$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. OL soy (OL) hücre toplama ve kültürü
NOT: Bu adımlar, steril koşullar altında laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir.
- Çalkalamadan sonraki gün Bottenstein-Sato (BS) ortamını Tablo 1'e göre hazırlayın.
- Kaplanmış Petri kaplarını steril damıtılmış su ile 3 kez durulayın.
- Esas olarak OL soy hücreleri ve aynı zamanda bazı mikroglial hücreler içeren şişelerin süpernatanını hasat edin ve kaplanmamış 100 mm Petri kapları üzerine koyun.
not: Bu adım, çanak yüzeyine diferansiyel hızlı yapışma yoluyla mikroglial hücrelerin uzaklaştırılmasına izin verir.
- Petri kaplarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında 15 dakika inkübe edin.
- Her bir T150 şişesini 25 mL ılık, taze hazırlanmış kültür ortamı ile doldurun ve ikinci çalkalamaya kadar 37 ° C'de% 5 CO2 altında nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
- Artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için süpernatanı Petri kaplarından yeni kaplamasız 100 mm Petri kaplarına aktarın.
- Petri kaplarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında 15 dakika inkübe edin.
- Yapışmayan OL soy hücreleri içeren süpernatanı çıkarın ve 50 mL'lik tüplere aktarın (50 mL'lik bir tüp için 2 Petri kabından süpernatant). Mikroglia ile kaplanmış Petri kaplarını atın.
- Süpernatanı 5 dakika boyunca 423 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 1 mL BS ortamı ile yeniden süspanse edin. Tüm peletleri 50 mL'lik ortak bir tüpte toplayın ve hacmi BS ortamı ile 10 mL'ye ayarlayın.
- Mikroskop altında hücreleri sayarak hücre yoğunluğunu belirleyin.
not: 3 x 105 hücre/mL ile 5 x 105 hücre/mL arasında bir hücre yoğunluğu elde edilmelidir.
- 30 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için hücre yoğunluğu 4 x 105 hücre / mL'ye eşit veya daha yüksekse 20 mL BS ekleyin veya hücre yoğunluğu 4 x 105 hücre / mL'den azsa sadece 10 mL BS ekleyin 20 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için.
- 10 mL hücre süspansiyonlu iki veya üç önceden kaplanmış 100 mm Petri kabı tabağı. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.
- 2 saat sonra tüm BS ortamını tazeleyerek Petri kaplarındaki kalıntıları temizleyin.
not: Hücre yoğunluğunu ve enkaz çıkarma verimliliğini doğrulamak için temizlemeden önce ve sonra kültürü mikroskop altında inceleyin.
- Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2.
altında BS ortamında 2 gün inkübe edin
not: Kültürü mikroskop altında inceleyin. Birleşme %70 ila %80 olmalıdır.
2. OCM üretimi
NOT: Bu adımları steril koşullar altında laminer akış başlığında gerçekleştirin.
- NB-B27low medium'u Tablo 2'ye göre hazırlayın.
- Kültür ortamını 10 mL ılık NB-B27low ortamı ile yenileyin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında 2 gün inkübe edin.
- OCM'yi, yani OL tarafından salgılanan faktörleri içeren süpernatanı hasat edin. OCM'yi 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreyle sterilize edin.
not: OCM'yi 4 °C'de en fazla 2 ay saklayın.
Tablo 1: Bottenstein-Sato (BS) ortamının hazırlanması.
| Bottenstein-Sato (BS) medyası | Son konsantrasyon |
| Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı | |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin insan | 100 μg/mL |
| BSA (Sığır Serum Albümini) | 100 μg/mL |
| Insülin | 5 μg/mL |
| PDGF (Doğa Koruma Fonu) | 10 ng/mL |
| Progesteron | 62 ng/mL |
| Putresin dihidroklorür | 16 μg/mL |
| Sodyum selenit | 40 ng/mL |
| T3 (3,3 ',5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Tiroksin) | 40 ng/mL |
Tablo 2: NB-B27low ve NB-B27 ortamının hazırlanması.
| NB-B27 düşük baskı malzemesi | Son konsantrasyon |
| Nörobazal | |
| B27 takviyesi | 0,5 kat |
| L-glutamin | 0,5 milyon |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
| NB-B27 ortamı | Son konsantrasyon |
| Nörobazal | |
| B27 takviyesi | 1 katı |
| L-glutamin | 0,5 milyon |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |