- Sıçan Dorsal Kök Gangliyonları (DRG'ler), Oligodendrositler (OPC'ler) ve hGC'lerin (insan glioma hücreleri) kompartmanlı kültürü
1. Bölmeli kültür kaplarının hazırlanması
NOT: DRG'lerin planlanan hasadından önceki günlerde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Bölmeli kültür kaplarını birleştirin.
- Kollajen stok çözeltisini steril damıtılmış H2O içinde 500 μg / mL'ye seyreltin; İyice karıştırın.
- Steril bir transfer pipeti ile 35 mm'lik bir kültür kabını 2 mL kollajen solüsyonu ile doldurun; solüsyonu çıkarın, geride ince bir kollajen filmi bırakın ve bir sonraki 35 mm'lik tabağa yerleştirin. Tüm bulaşıklar kaplanana kadar gerektiği kadar daha fazla kollajen çözeltisi ekleyerek bu işlemi tekrarlayın.
- Tüm plakalar kaplandıktan sonra, plakaları 245 mm x 245 mm'lik bir kültür tepsisine yerleştirin ve tepsinin ortasına üç adet 1 mm x 1 mm gazlı bez pedi yerleştirin.
- Kollajeni polimerize etmek için gazlı bezleri 1 mL konsantre amonyum hidroksit ile ıslatın ve tepsileri 15 dakika boyunca örtün.
- Gazlı bezleri çıkarın ve 35 mm'lik bulaşıkların laminer akış başlığında kurumasını bekleyin.
- Bulaşıklar kururken, şırınga gres aplikatörünün namlusunu yüksek vakumlu gres ile doldurun. Bölmeli hazneleri damıtılmış suyla doldurulmuş büyük ağızlı bir ortam şişesine yerleştirin. Her ikisini de otoklavlayarak sterilize edin ve soğumaya bırakın.
- Künt bir uç yapmak için iğnelenmiş 18-G'nin ucunu törpüleyin. % 70 etanol içinde sterilize edin. İğneyi yağ şırıngasına takın.
- Pimli tırmığı %70 etanole batırarak sterilize edin; laminer akış başlığında kurumaya bırakın.
- Kapağı kuru, kollajen kaplı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Çanağı başparmağınız ve işaret parmağınız arasında tutun. Pimli tırmığı diğer elinizle tutun. Çanağın ortasında 200 μM genişliğinde çizikler oluşturmak için sıkı bir baskı uygulayın.
- Bir mera pipeti kullanarak, çiziklerin ortasına iki damla Takviye Edilmiş Nöronal Bazal Ortam yerleştirin.
- Tüm bulaşıklar çizilene kadar 1.1.10-1.1.11 adımlarını tekrarlayın.
- Bölmeli odaları laminer bir akış başlığında kurutun.
- Steril hemostatik forsepslerle, bölmeli bir odayı merkez bölücü ile kavrayın. Hemostatik forsepsleri, odanın alt kısmı yukarı bakacak şekilde çevirin.
- Bölmeli hazneye üstten başlayarak silikon gres sürün. Gresin düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden ve tüm köşelerde üst üste geldiğinden emin olun.
- Kapağı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Çanağı ters çevirin ve çizikleri haznenin üzerine yerleştirin. Plakanın altına bir çift forseps ile hafifçe vurun.
- Hemostatik forsepsleri kullanarak plakayı yavaşça ters çevirin. Forsepsleri serbest bırakın.
- Orta bölmenin tabanına bir yağ höyüğü yerleştirin. Her odayı Takviye Edilmiş Nöronal Bazal Ortam (NB) ile doldurun ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sızıntıları gerektiği gibi silikon gres ile kapatın.
- Tüm kültür kaplarını birleştirmeye devam edin ve gece boyunca 37°C, %5 CO2'de saklayın.
