Nöral krest hücre kültürü için bir civciv embriyosundan kraniyal nöral kıvrımların izole edilmesi

Özet

Kaynak: Jacques-Fricke, B. T., et al. Civciv Kraniyal Nöral Krest Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, civciv embriyolarının orta beyin bölgesinden kraniyal nöral kıvrımları izole etmek için bir tekniği göstermektedir. Nöral kıvrımların ayrıntılı bir diseksiyon sürecini, bunların yerleştirilmesini ve fibronektin kaplı lameller üzerine bağlanmasını ve ardından nöral kıvrımlardan nöral krest hücre göçünün gözlemlenmesini sunar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Çözelti ve malzemelerin hazırlanması

1. 123.3 mM NaCl, 1.53 mM CaCl₂, 4.96 mM KCl, 0.809 mM Na₂HPO₄ ve 0.147 mM KH₂PO₄'ü karıştırarak Ringer çözeltisini hazırlayın (bkz. PH'ı 7.4'e ayarlayın ve 100 mL'lik şişelere sterilize edin. Temiz ve kuru bir yerde saklayın. Şişeleri sabunla yıkamayın (doku kültürü cam eşyası olarak kabul edin).
2. FN'yi steril Ringer solüsyonunda çözerek 1 mg / mL stok çözeltisi fibronektin (FN) (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve -80 ° C'de 100 μL'lik alikotlarda saklayın (en az 4 yıl stabil).
3. L15 ortamını %0.8 L-glutamin, %0.08 penisilin / streptomisin, %10 FBS ve %10 civciv embriyo özü ile destekleyerek tam kültür ortamı hazırlayın. 3 mL alikot oluşturun ve -20 °C veya -80 °C'de saklayın.
   not: Kültürler bir CO₂ inkübatöründe inkübe edilirse, Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium F12'sinin (DMEM / F12), hava için tamponlanan L15 ile ikame edilmesi gerekir.
4. Filtre kağıdı destek çerçeveleri hazırlayın (yaklaşık 1 cm x 1,5 cm dikdörtgen kağıtlar, uzun eksende üst üste binen iki veya üç delikli delikler).
   1. Standart bir üç delikli zımba kullanarak büyük bir filtre kağıdı parçasının kenarı boyunca delikler açın, delinmiş kenarı bir şerit halinde kesin/düzeltin ve ardından delikler arasındaki şeridi ~ 1,5 cm uzunluğunda dikdörtgenler halinde kesin. Kullanmadan önce filtre kağıtlarını otoklavlayın (isteğe bağlı).
5. İnce forseps (# 5), künt forseps, diseksiyon makası, yaylı makas ve keskinleştirilmiş tungsten iğneleri dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini toplayın.

2. Kültür yemeklerinin hazırlanması

1. Aşağı akış uygulaması için uygun nöral kıvrım kültürü kaplarını seçin (Malzeme Tablosuna bakın).
   1. Sabitlenecek ve lekelenecek kültürler için, çok kuyulu doku kültürü kaplarına yerleştirilmiş cam lameller kullanın.
      not: Kuyu boyutuna uyan lameller, sıvı karıştırma ile daha az hareket edecek, bu da eksplantların kayma olasılığını azaltacak ve çanak tabanından ziyade lame yapışma olasılığını artıracaktır.
   2. Ters çevrilmiş mikroskopla canlı görüntüleme için cam tabanlı tek hazneli veya bölünmüş hazneli tabakları seçin (Malzeme Tablosuna bakın).
   3. Dik veya stereo mikroskopta canlı görüntüleme için 6, 12 veya 24 oyuklu optik olarak uygun doku kültürü plakaları kullanın.
   4. Yüksek verimli analizler için göçmen nöral krest hücrelerinin toplu toplanması için plastik doku kültürü kaplarını seçin.
2. 100 mL'lik bir steril Ringer çözeltisine 10 U / mL penisilin ve 10 μg / mL streptomisin ekleyin (örneğin, 100 μL 10.000 U / mL penisilin ve 10.000 μg / mL streptomisin, Ringer'in P / S'sini yapmak için). Ringer'ın P/S'sini 1 hafta içinde kullanın.
3. Buz üzerinde 1 mg / mL FN'lik bir alikotu çözün. Ringer'ın P / S ile 10-100 μg / mL FN konsantrasyonuna kadar seyreltin.
4. Kuyu veya tabağın dibini kaplayacak kadar FN solüsyonu pipetleyin. Örneğin, 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 100 μL, 35 mm'lik bir tabak için 500 μL.
5. Kapağı değiştirin ve nöral kıvrımları incelerken en az 1 saat boyunca 38 ° C'de (100 ° F) nemlendirilmiş bir inkübatörde (veya damıtılmış suya batırılmış kağıt havlularla kaplı bir tepside) tabakları veya plakaları FN solüsyonu ile inkübe edin.

3. Nöral kıvrımların diseksiyonu

1. Bir embriyoyu Ringer'in P / S solüsyonunu içeren temiz bir tabağa aktarın ve filtre kağıdı çerçevesini forseps ile tutarak ve embriyonun görüşünü engelleyen yumurta sarısını temizlemek için hafifçe ileri geri sallayarak embriyoyu durulayın. Ringer'ın P/S'sini değiştirin veya hava bulanıklaşırsa taze bir yemeğe aktarın.
2. Embriyo dorsal / çerçeve tarafını diseksiyon mikroskobu altında konumlandırın. Embriyoyu gergin tutmak ve yerinde tutmak için kağıt çerçeve üzerinde bırakarak, nöral kıvrımları ortaya çıkarmak için forseps kullanarak vitellin zarını çıkarın.
   not: Embriyo kağıt çerçeveden düşerse, tabağa düz bir şekilde yerleştirilebilir veya diseksiyon için sylgard kaplı bir tabağa tutturulabilir.
3. Yaylı makas veya keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesi kullanarak, orta beyin nöral kıvrımlarını dikkatlice çıkarın. Genişleyen optik veziküllere doku kaudal ve eşkenar dörtgen daralmalarının yeni ortaya çıkmaya başladığı arka beyne rostral dahil edin (kardiyak hilal de yararlı bir göstergedir, Şekil 1B, C). Nöral kıvrımın en dorsal yönünü minimal kontamine nöral tüp ve nöral olmayan ektoderm ile eksize etmeye özen gösterin (Şekil 1C).
4. Nöral kıvrımları, bir P20 pipetleyici veya sarısı Ringer's P/S ile durulanmış steril bir cam Pasteur pipeti kullanarak Ringer'ın P/S'sini içeren temiz bir tabağa aktarın (bu, dokunun yapışmasını önlemek için plastiği veya camı bloke eder). Ek kıvrımları incelerken toplanan kıvrımları buz üzerinde saklayın.

4. Nöral kıvrımların kaplanması

1. Tam kültür ortamının bir kısmını çözün (bölüm 1, adım 3). 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ekleyin ve filtre sterilize edin. Diğer adımları gerçekleştirirken hazırlanan ortamı 37-38 °C'de tutun.
2. Kültür kaplarını inkübatörden çıkarın (bölüm 2, adım 5). Bir pipetleyici veya Pasteur pipeti kullanarak FN solüsyonunu lamellerden, tabaklardan veya kuyulardan çıkarın. FN kaplı alt tabakayı Ringer'ın P/S'si ile duruladıktan sonra, bulaşıklara veya kuyucuklara uygun hacimde tam kültür ortamı ekleyin (24 oyuklu bir plakadaki kuyucuklar için 500 μL, 35 mm'lik bir tabak veya altı oyuklu bir plaka için 2 mL).
   not: Daha küçük hacimler pahalı reaktifleri koruyabilir (örneğin, 24 oyuklu bir plaka için 200 μL kadar düşük), ancak buharlaşmayı önlemek için yemeğin yeterince nemlendirildiğinden emin olun.
3. Bir p20 veya p200 pipetleyici kullanarak, plastiği bloke etmek ve dokunun yapışmasını önlemek için önce pipet ucunu sarılı Ringer'ın P/S'si ile durulayın. Ardından, izole edilmiş nöral kıvrımları FN kaplı lamellere aktarın ve mümkün olduğunca az Ringer'ın P / S'sini aktarmaya dikkat edin. Kıvrımları FN kaplı lamel ortasına doğru yerleştirin.
   not: Bir veya birkaç nöral kıvrım, 19 mm'lik bir kuyuda 12 mm'lik bir lamel üzerine, 35 mm'lik bir plaka üzerinde 50'ye kadar kaplanabilir.
4. Eksplantların 10-15 dakika dinlenmesine izin verdikten sonra, kaplanmış nöral kıvrımlara sahip kültür kaplarını yavaş ve dikkatli bir şekilde taşıyarak 38 ° C'de (100 ° F) nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Bu, kuyucuklardaki nöral kıvrımların kaymasını en aza indirecek, dağınık kalmalarını ve herhangi bir lamellere yapışmalarını sağlayacaktır.
   not: L15 (DMEM değil) kullanılırken, eksplant kültür kapları, nemli kağıt havlularla kaplı bir tepsi kullanılarak bir yumurta kuluçka makinesinde de inkübe edilebilir.
5. Nöral kıvrım kültürlerini nemlendirilmiş inkübatörde aktif göç süresi boyunca inkübe edin (toplamda yaklaşık 16-20 saat, Şekil 2).

Sonuçlar

Şekil 1. Civciv dorsal nöral kıvrımlarının diseksiyonu. Ringer'ın P / S'sinde çalışırken, nöral kıvrımları çıkarmak için yaylı makas kullanıldı. (A) Embriyo dorsal görünümü, şeklin tepesine doğru ön. Nöral kıvrımlar, çevreleyen dokudan daha opak görünür. Orta beyin nöral kıvrımları, optik lobların arkasında (pembe) ve kalp hilalinin (sarı) önünde yer alır. (B) Nöral k...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ZEN 3.0 SR yazılımı tarafından kontrol edilen bir LSM710 konfokal tarama kafası ile donatılmış AxioObserver	Zeiss		Kullanılan alfa Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objektif
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
Oda tabakları (cam altlı, tek veya bölünmüş)	MatTek; Hücre Visi	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	Tek odacıklı 35 mm veya 4 odacıklı 35 mm
Kapak camı	Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	Daireler, 0,13–0,17 mm kalınlık, 12-25 mm çapında mevcuttur
DMEM/F12	ThermoFisher Bilimsel	11320033	L15 medya için alternatif
Yumurta kuluçka makinesi	sporcu	1502
FBS (FBS)	Yaşam Teknolojileri	10437-028
Fibronektin	Balıkçı Bilimsel	CB-40008A
Filtre kağıdı	Ne adam		sınıf 3MM kromatografi
Forseps (künt)	Fisher Bilimsel; Thomas Bilimsel	08-890 (Balıkçı); 1141W97 (Thomas)
Forseps (iyi)	Güzel Bilim Araçları	11252-20	Dumont #5
Pim tutucu	Güzel Bilim Araçları	26016-12	Tungsten iğnesi için (yaylı makas için alternatif)
Kartal	Sigma-Aldrich	P3911 Serisi
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662 Serisi
L15 medya	Canlandırıcı	11415064
L-glutamin	Canlandırıcı	25030
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9638 Serisi
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S9888 Serisi
Penisilin / streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-148	10.000 birim / mL penisilin; 10.000 mg / mL streptomisin
Petri Kapları	VWR (veya muadili)		60 mm, 100 mm
Makas (diseksiyon)	Güzel Bilim Araçları	14061-10
Yaylı Makas	Güzel Bilim Araçları	15000-08	2,5 mm kesme kenarı (tungsten iğnesi için alternatif)
Sylgard Belediyesi	Krayden Belediyesi	Sylgard 184
Şırınga Filtreleri	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Millex-GV Şırınga Filtre Ünitesi, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gama sterilize
Doku kültürü yemekleri	Sarstedt	83-3900	Toplu nöral kıvrım kültürleri için 35 mm kültür kapları
Tungsten tel	Kaynak çeşitliliği		Tungsten iğnesi için 0.01 "çap (yaylı makas için alternatif)

Gazetesi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Belediyesi arası