Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlıklar
>NOT: Bu bölümde açıklanan çözümler ve araçlar çok önceden yapılabilir ve diseksiyon ve kayıt gününde kullanılabilir.
- 10 mM HEPES (L-15 çözeltisi) ile desteklenmiş Liebovitz ortamını hazırlayın. Aşağıdaki adımlar, 1 L L-15 çözeltisinin yapılmasını açıklamaktadır.
- 990 mL deiyonize H2O'yu bir behere dökün. 2.386 g (10 mM) HEPES ölçün ve ekleyin. Bir şişe 1 L L-15 çözelti tozu ekleyin.
NOT: Toz haline getirilmiş L-15 daha uzun raf ömrüne sahiptir ve daha az depolama alanı kaplar. Alternatif olarak, L-15 çözeltisi satın alın ve HEPES ile destekleyin. İkinci seçenek, floresan görüntüleme için yararlı olan fenol içermeyen bir çözelti kullanma seçeneğine de sahiptir.
- Çözeltiyi bir karıştırma plakasında karıştırın. Bir pH metre kullanarak, 7.34 ile 7.36 arasında bir pH elde etmek için yavaşça 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin.
- Çözelti 1.000 mL'lik bir hacme ulaşana kadar deiyonizeH2Oekleyin. Çözeltiyi 0,22 μm gözenek boyutunda bir membran kullanarak filtreleyin.
not: L-15 çözeltisi 4 ° C'de 1-2 hafta saklanabilir. Fenol kırmızısı ile yapılan L-15 kullanılıyorsa, çözelti çok bazikse (pH > 7.4) veya çok asidikse turuncuya (pH < 7.34) dönecektir.
- Vestibüler ganglion nöronları (VGN'ler) için kültür ortamını hazırlayın. 50 mL kültür ortamı yapmak için aşağıdaki adımları izleyin:
- Temiz bir cam kabına 47,5 mL GluMAX-I minimum esansiyel ortam ekleyin.
- 0.1194 g (10 mM) HEPES ölçün ve ekleyin. Bu ek tampon, hücreler inkübatöre taşınmadan önce çökelirken pH değişikliklerine direnir.
- 2.5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Bu, toplam 50 mL ortam hacminde hacimce% 5 FBS yapar.
- Çözeltiyi bir karıştırma plakasında karıştırın. Bir pH metre kullanarak, 7.38 ile 7.4 arasında bir pH elde etmek için yavaşça 1 N NaOH ekleyin.
- 0.5 mL penisilin-streptomisin ekleyin. Çözeltiyi 0.22 μm steril bir filtreden süzün. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
- Kullanmadan en az 30 dakika önce, kültür ortamını havalandırmalı bir kapağı olan bir doku kültürü şişesine aktarın. Kültür ortamı içeren şişeyi 37 °C'de %5 CO2 konsantrasyonuna sahip bir inkübatöre yerleştirin.
2. Öğütme pipetlerinin imalatı
NOT: Öğütme pipetleri birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Her kullanımdan önce pipetleri etanol, su ve L-15 solüsyonu ile yıkayın ve her kullanımdan sonra su ve etanol ile temizleyin. Kullanımlar arasında dikkatlice saklayın.
- Hücre ayrışması için öğütme pipetleri hazırlamak için, bir Bunsen brülörünün alevine bir cam Pasteur pipeti tutun. Cam uç erimeye başladığında, camı istenen uç çapına kadar gerin. Küçük bir kıvrım oluşturmak için pipetin bir ucunu alevden çekin.
- Bükülmüş pipeti mikroskobun yanına getirin. Bir puanlama karosu kullanarak, camı istenen çapta çizin ve kırın.
- Pipetin ucunu Bunsen brülör alevinin üstünden geçirin. Bu, uca yakın pürüzlü kenarları hızla parlatacaktır. Ucun alevle kapatılmadığından emin olmak için kontrol edin.
- Farklı boyutlarda dört veya beş pipet hazırlanana kadar işlemi tekrarlayın.
3. Vestibüler ganglionun çıkarılması ve vestibüler nöronların kaplanması
- Diseksiyon için hazırlık
- % 0.05 kollajenaz ve% 0.25 tripsin içeren bir L-15 çözeltisi enzim karışımı hazırlayın. Örneğin, bir behere 2 mL L-15 çözeltisine 0.001 g kollajenaz ve 0.005 g tripsin ekleyin, küçük bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve tamamen karışana kadar karıştırın. Oda sıcaklığında bir kenara koyun.
- Tezgah üstü ve diğer yüzeylerin kan ve diğer biyolojik materyallere maruz kalmasını en aza indirmek için giyotinin yanına ve altına kağıt havlu koyarak ticari olarak elde edilmiş bir giyotin hazırlayın.
- Büyük paslanmaz çelik makas, büyük forseps ve büyük yaylı makas yerleştirin. Kafa temizliği için elinizin altında %70 etanol içeren büyük bir sprey şişesi bulundurun.
- 100 mL'lik bir kabı L-15 çözeltisi ile doldurun ve buzun üzerine yerleştirin. L-15 çözeltisini oksijenlendirin.
- Yaylı maaşı, cerrahi makası, forseps, neşter ve transfer pipetini yerleştirin (bkz.
- Bir 60 mm Petri kabı (brüt diseksiyon için) ve iki adet 35 mm Petri kabı (ganglionların temizliği/ince diseksiyonu için) hazırlayın. 0,22 μm filtre ucuna sahip 30 mL'lik bir şırınga kullanarak 60 mm'lik çanağı oksijenli L-15 solüsyonu ile doldurun.
- Ötenazi, kafa temizleme ve hemiseksiyon
- İntraperitoneal olarak uygulamak için uygun ölümcül artı seyreltme dozunu hesaplamak için yavruları tartın (10 g'da ~ 0.01 mL).
- Derin bir anestezi düzlemine ulaşıldığında, ayak parmağının sıkışmasına yanıt eksikliği ile değerlendirildiği gibi, giyotin kullanarak dekapitasyon yapın.
- Kafayı% 70 etanol ile iyice durulayın ve ardından L-15 çözeltisi ile iyice durulayın.
- Cildi kafatasından tamamen çıkarın. Omuriliğin beyne giriş noktasından başlayarak ve ilki kafatasının üstünden ve ikincisi çenenin altından olmak üzere iki kesik yaparak büyük yaylı makas kullanarak kafayı ikiye bölün. Cerrahi makas kullanarak kafayı ikiye bölmeyi bitirin.
- Başın her iki yarısını da beyin tarafı aşağı bakacak şekilde L-15 solüsyonu ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Şu anda diseke edilmeyen taze dokuyu buzun üzerine yerleştirin.
- Superior vestibüler ganglionun çıkarılması
- Kapalı cerrahi makas kullanarak beyni çıkarın. Beyni kafatasından tamamen ayırmak için kraniyal siniri kesin ve çıkarın.
not: Bu noktada, otik kapsül (8 numara şeklinde) başın arkasında görünür olmalıdır.
- Forseps kullanarak ve başın arkasından başlayarak, şeffaf membranöz materyali çekin.
- Cerrahi makas kullanarak kafatasının üst kısmını kesin. Diseksiyon alanını ve otik kapsülü daha temiz ve daha kolay erişilebilir hale getirmek için başın ve boynun arkasındaki fazla dokuyu çıkarın.
not: İşlem boyunca fazla dokuyu atarak yemeği çok bulanık hale getirmekten kaçının.
- Dokuyu taze L-15 çözeltisi ile ikinci bir Petri kabına aktarın. Otik kapsülü ve işitsel, superior vestibüler ve inferior vestibüler sinirleri bulun. İşitme sinirini kesin ve küçük yaylı makas kullanarak üst ve alt gangliyonları ayırın.
not: Vestibüler sinirin somatları hem inferior (daha ince) hem de superior (daha kalın) gangliyonlarda bulunmasına rağmen, superior gangliondan çıkarılan hücreler daha iyi sağkalıma sahiptir.
- Bir neşter kullanarak, sinirin kemikli kapsüle daldığı kemikli bölgeyi zayıflatmak için kemikli sırtı nazikçe tıraş edin. Ganglionun tüm şişmiş kısmını açığa çıkaran ince forseps ile kalıntıları dikkatlice çıkarın.
- Gangliyonu, utriküle doğru dalan periferik sinir dalından kesmek ve ayırmak için ince yaylı makası kullanın.
- İnce forseps kullanarak üst gangliyonu çıkarın, ganglionik dokuya çok yakın sıkıştırmamaya dikkat edin. Taze L-15 çözeltisi ile 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
- Devam etmeden önce, enzim çözeltisini önceden ısıtın: enzim karışımını 35 mm'lik bir Petri kabına dökün ve 37 °C'lik bir inkübatörde 10-15 dakika bekletin.
- Ganglionu ince forseps ve küçük yaylı makas kullanarak, kemiği (beyaz ve yapıda kristalize görünen), fazla dokuyu, sinir liflerini ve diğer gereksiz yapıları çıkararak temizleyin. Herhangi bir ganglionik dokunun çıkarılmasını en aza indirmeye özen gösterin.
- Doku ayrışması ve kaplama
- Temizlenmiş gangliyonları önceden ısıtılmış enzim çözeltisine aktarın ve 10 ila 40 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Enzim tedavisi, doku parçalanmaya başladığında tamamlanır, ancak tek parça halinde kalır. Dokunun enzimlerle aşırı muamele edilmesi, ganglionların tritürasyondan önce tamamen çözünmesine neden olacaktır.
NOT: Dokunun enzimatik muameleye tabi tutulma süresi hayvanın yaşına bağlıdır. Örneğin, P9 sıçanlarından gelen gangliyonlar 25 dakika boyunca enzim ile muamele edilir ve P15 sıçanlarından gelen gangliyonlar 35 dakika boyunca enzim ile tedavi edilir.
- Gangliyonları taze L-15 çözeltisi ile 35 mm'lik Petri kabına aktarın ve 2-3 dakika inkübe edin.
- Gangliyonları, filtrelenmiş kültür ortamı ile doldurulmuş başka bir 35 mm Petri kabına aktarın.
- 200 μL'lik bir mikropipet kullanarak, ~150 μL'lik bir damla filtrelenmiş kültür ortamını kaplanmış bir cam tabanlı tabağa pipetleyin. Çok fazla çözelti eklemeyin, çünkü cam lamel üzerinde kalan bir çözelti kabarcığı oluşturmak için yüzey gerilimini korumak önemlidir.
- İstenilen sayıda gangliyonu (bir ila dört) lamel üzerine aktarın.
- Dokunun cam pipetin kenarlarına yapışmasını önlemek için öğütme pipetini orta ile durulamak için kültür kabından az miktarda kültür ortamı çekin. Ganglionlar yeterince ayrışana kadar dokuyu pipetten nazikçe ve tekrar tekrar geçirerek eziyet edin.
not: Tek hücreli süspansiyonları denemek için dokuyu fazla çalıştırmayın veya aşırı pozitif basınç kullanarak hücrelerin tabağın dibine çarpmasına izin vermeyin. Ayrıca, hücre sağkalımını azaltacağı için hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Nazik öğütme, başarılı hücre sağkalımını sağlamanın anahtarıdır.
- Hücreleri 5 dakika dinlendirin. Hücrelerin lamel üzerine yerleşip yerleşmediğini görmek için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
- Bir kültür kabını 12-24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin. Yine, çözelti kabarcığını sağlam tuttuğunuzdan emin olun.
not: 24 saatten daha uzun süre kültür yaparken, kültür ortamını günlük olarak yenileyin. Bu olası bir duraklama noktası olabilir.
