$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Doku ayrışması
NOT: Aşağıdaki tüm işlemler, aseptik teknik ve steril malzemeler kullanılarak steril doku kültürü belirlenmiş biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
- Doku lizizini başlatmak için 9 mL DMEM ve dokuya her 15 mL konik tüpe 0.53 mM EDTA içeren 1 mL %0.05 tripsin ekleyin.
not: DMEM, tripsin inhibitörü olarak işlev görebilen yüksek miktarda kalsiyum klorür içerir. Belirtilen adımları izleyerek ayrışma tamamlanmazsa, Hanks'in kalsiyum veya magnezyum içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi kullanılabilir. Tripsinizasyondan sonra, enzim bir tripsin inhibitörü eklenerek nötralize edilebilir, ancak sonraki adımlarda kullanılan DNaz I için bir kofaktör olduğu için çözeltiye kalsiyum geri eklenmelidir.
- 10 mL'lik bir pipetle yaklaşık 20x ezin.
- Hücre süspansiyonlarını boş 50 mL'lik konik tüplere aktarın.
- Çözeltiyi 37 ° C,% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin, lizatları 8 dakika sonra hafifçe çalkalayın.
- 50 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için her tüpe 5 mL MGM ve 200 μL (5 mg / mL) DNaz I ekleyin.
- Her bir lizatı 10 mL'lik bir pipetle 10x triture edin.
- Hücre süspansiyonlarının, ayrışmamış dokunun tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 3 dakika bekletin.
- Hücre süspansiyonlarını yeni 50 mL'lik konik tüplere aktarın ve ayrışmamış dokuyu geride bırakın.
not: Yukarıda tarif edilen lizis ve tritürasyon adımları, ayrışmamış doku miktarını önemli ölçüde sınırlar.
- Tüpleri frensiz olarak 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve kalan hücre peletlerini 5 mL MGM'de yeniden süspanse edin.
- Peleti 5 mL'lik bir pipetle 20x ezin.
- 5 mL hücre süspansiyonlarını kaplanmış T25 şişeleri üzerine yerleştirin.
- Hücreleri 37 °C,% 5 CO2'de inkübe edin ve hücre kalıntılarını gidermek için başlangıçta 24 saat sonra ortamı değiştirin.
not: Bazı protokoller, 72 saat sonra ilk medya değişikliğini önerir. Bu adımın optimizasyonu gerekli olabilir.
- Hücreler %80 birleşene kadar (yaklaşık 5-7 gün) her 48-72 saatte bir MGM ile %100 medya değişikliği gerçekleştirin.
NOT: Ortam değiştirilmeden önce tüm ortamlar 37 °C'ye ısıtılmalıdır.
2. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonu
İlk izolasyonu takiben OPC'leri kaplarken, poli-D-lizin kaplı bir yüzey (steril plaka veya lamel) üzerine kaplanmalıdır. Bu bölümü tamamlamadan önce bu malzemeleri hazırlayın.
- 15 saatlik çalkalamanın ardından, süpernatanı şişelerden çıkarın ve steril bir 100 mm Petri kabına koyun.
- Süpernatanı 37 °C'de,% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin, kalan mikrogliaları çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün, çünkü bunlar yemeğe çok hızlı bir şekilde yapışacaktır. Bu adım için doku kültürü ile muamele edilmemiş Petri kapları kullanılabilir.
- Poli-D-lizin kaplı bir yüzey üzerinde yapışmayan hücre süpernatanın, sayımını ve plakasını çıkarın. Tipik olarak, 7.500-10.000 OPC kaplanır /cm2.
- 37 °C, %5 CO2'de en az 1 saat (6 saate kadar) inkübe edin, ardından ortamın %95'ini nazikçe aspire edin ve OPC'lerin bozulmasını en aza indirmek için ortamı kuyu duvarına pipetleyerek yavaşça ılık OPC Ortamı ekleyin. Hücreler kullanıma hazır olana kadar her 48 saatte bir ortamı değiştirin.
NOT: Bir seferde yalnızca bir kuyunun değiştirilmesi çok önemlidir. OPC'ler hassastır ve özellikle kuru koşullara karşı toleranssızdır. OPC ortamına PDGF-AA'nın eklenmesi, OPC'nin oligodendrositlere olgunlaşmasını geciktirmektir. Deneysel odak olgun oligodendrositler ise, bu faktör kültür ortamından çıkarılabilir.
Tablo 1: Tampon ve Ortam Tarifleri.
Karışık Glia Ortamı (MGM)
| 88 mL | 1X DMEM (yüksek glikoz, L-glutamin ile, Na piruvat ile) |
| 10 mL | Isı ile etkisiz hale getirilmiş FBS |
| 1.0 mL | L-Glutamin (100X) |
| 1.0 mL | Antibiyotik/Antimikotik |
>OPC Ortamı (50mL)
)
| 49 mL | Nörobazal medya |
| 1.0 mL | B27 takviyesi (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA (AA |
| >NOT: PDGF-AA, her ortam değişikliğinden önce yeni eklenir. |