İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretme Tekniği

Özet

Kaynak: Boisvert, E. M., et al. İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek İçin Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem. J. Vis. Exp (2020).

Bu videoda, insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC'ler) serebral organoidler üretmeye yönelik bir teknik gösterilmektedir. hESC kolonilerinin yapışık kültürü, onları ayırmak ve kümelere ayırmak için enzimlerle muamele edilir. Bu kümeler, süspansiyon halinde üç boyutlu küreler oluşturur ve bunlar daha sonra nöron katmanları ve glial hücrelerle beyin korteksini taklit eden organoidlere farklılaşmak için indüklenir.

Protokol

1. Kök Hücre Bakımı

1. H9 hESC'leri, üreticinin talimatlarına göre bir büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi tabakası üzerinde tutun (Malzeme Tablosuna bakın, bundan böyle basitçe matris olarak anılacaktır).
   1. Bir adet 6 oyuklu plakayı veya bir adet 10 cm'lik tabağı kaplamak için 100 μL matrisi 5,9 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM)/F12 ortamıyla birleştirin. Plakaları parafin filme sarın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Fazla matris / ortam aspire edildikten sonra hücreleri geçirmek için ertesi gün kullanın.
2. Hücreleri haftadan haftaya her 7 günde bir yaklaşık 1:12 bölünme oranında kültürleyin. Hücreleri mTESR-1 ortamı kullanarak 37 ° C, düşük oksijenli bir inkübatörde (% 5 O₂,% 5 CO₂) koruyun. Medyayı günlük olarak yenileyin. Cam aletler kullanarak pasajlar arasındaki kültürden farklılaşan hücreleri ayıklayın.
3. H9 hücreleri, organoidler üretmek için kullanılmadan dört ila altı gün önce geçirilmelidir. Hücreler, hücre kümelerinin yaklaşık 1: 8 oranında geçilmelidir. Bunu yapmak için, hücreleri Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ortamı ile durulayarak başlayın ve hücreleri nötr bir proteaz ile ayırın (örneğin, dispase, bundan böyle basitçe proteaz olarak anılacaktır), DMEM/F-12 ile durulayın ve ~%20 birleşmede 4 plaka (6 oyuklu veya 10 cm) boyunca 30-60 hücre kümesi halinde plaka. Hasattan iki gün önce, onları normal bir inkübatöre geçirin (% 21 O₂,% 5 CO₂). Organoid oluşumuna başlarken plakalar ~% 80 birleşmeye ulaşmalıdır.

2. Organoid Kültür için hESC'lerin Ayrışması

1. Proteaz stok çözeltisini (5 U/mL) alikotlayın.
   not: Genellikle birkaç ay boyunca kullanmak üzere -20 ° C'de 1 mL alikotları dondururuz.
2. Her 6 oyuklu veya 10 cm'lik hESC plakası için 1 mL stok çözeltisi artı 5 mL DMEM/F12 ekleyerek proteaz stok çözeltisini çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
3. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve çıkarın, ardından hESC'leri proteaz çözeltisi ile örtün. Plakaları 10-15 dakika veya kolonilerin kenarları yuvarlanıp matristen ayrılmaya başlayana kadar inkübatöre yerleştirin.
4. Plakayı eğin, proteaz solüsyonunu aspire edin ve hücreleri DMEM / F12 ile üç kez nazikçe yıkayın. 6 oyuklu bir plaka kullanırken her yıkama için 2 mL / kuyu ve 10 cm'lik bir plaka kullanırken 6 mL kullanın. Bu adımı gerçekleştirirken kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun.
5. Her bir oyuğa yaklaşık 1,5 mL taze mTESR ortamı (veya 10 cm'lik bir plaka için 5 mL) ekleyin ve hücreleri hafif pipetleme kullanarak plakadan yıkayın.
6. 10 mL'lik bir pipet kullanarak, hESC'yi orijinal boyutlarının yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde nazikçe aspire edin ve dağıtın. Koloni kümeleri bu adımların tamamlanmasında ~250-350 μm büyüklüğünde karelere benzemelidir.

3. Organoidlerin Oluşumu

1. Hücreleri, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) içermeyen 30 mL mTESR ortamı içeren tek bir ultra düşük bağlantılı T75 şişesine aktarın.
2. Ertesi gün, şişe(ler)i canlı hücreler köşede toplanacak şekilde eğin (bu ilk gün 5-10 dakika sürebilir, ancak kümeler büyüdükçe daha da hızlanacaktır).
   not: Bu adımda veya sonraki adımlarda şişenin dibine yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarın. İlk iki gün boyunca yüksek bir ölü hücre popülasyonuna sahip olmak normaldir. Ortam değişiklikleri yaparken, mümkün olduğunca çok hücre kalıntısını çıkardığınızdan emin olun.
3. Hücreler yerleştikten sonra, ortamı ve ölü hücreleri aspire edin ve canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mL ortam bırakın.
4. ~ 20 mL düşük bFGF ortamı ekleyin (1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA),% 0.05 sığır serum albümini (BSA) ve 0.1 mM monotiyokirol (MTG) 30 ng / mL bFGF ile desteklenmiş).
5. 2. günde hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünüyorsa, hiçbir şey yapmaya gerek yoktur. Bununla birlikte, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu görünüyorsa, ortamı (adım 3.2'deki gibi aynı eğme tekniğini kullanarak) 20 ng / mL bFGF ile desteklenmiş ~ 20 mL düşük bFGF ortamı ile değiştirin.
6. 3. günde, ortamın yarısını (adım 3.2'deki eğme tekniğini kullanarak) 10 ng / mL bFGF ile desteklenmiş 20 mL düşük bFGF ortamı ile değiştirin.
7. 5. günde, ortamın yarısını (adım 3.2'deki eğme tekniğini kullanarak) 20 mL nöral indüksiyon ortamı (NIM: DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg / mL heparin) ile değiştirin.
   not: Diğerlerinden çok daha büyük büyük hücre kümeleri veya organoidler varsa, bunlar kültürden çıkarılmalıdır. Boyut, mikroskop altında görünüşe göre tahmin edilir; Örneğin, retiküllü bir mercek kullanmak. Organoidlerin çoğu benzer boyuttadır (kabaca 100 ± 20 μm). Diğerlerinden yaklaşık 2 kat daha küçük veya daha büyük olan organoidleri çıkardık.
8. Ortamın yarısını (~ 15 mL) (eğme tekniğini kullanarak) her gün NIM ile değiştirin.
9. Kültürde 3 hafta sonra, ortama 100x penisilin / streptomisin ekleyin (NIM: DMEM / F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg / mL heparin) istenirse 1x nihai konsantrasyonda. Medyayı iki günde bir yenileyin.
   not: Bu şekilde, organoidleri kültürde 6 aya kadar koruduk.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B27 Takviyesi	Gibco, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	17504-044
bFGF (İngilizce)	Yaşam Teknolojileri, Carlsbad, CA, ABD	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	A9647
Dağıtma	STEMCELL Teknolojileri, Vancouver, Kanada	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD	11330-032
DPBS (DPBS)	Gibco, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	10010023
Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel (Matris)	Corning, Corning, NY, Amerika Birleşik Devletleri	356231
H9 hESC'ler	WiCell, Madison, WI, Amerika Birleşik Devletleri	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	9041-08-01
L-glutamin	Gibco, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	25030-081
Monotiyokliserol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	M6145
mTESR ortamı	STEMCELL Teknolojileri, Vancouver, Kanada	85850
N2 NöroPlex	Gemini Biyo Ürünleri, West Sacramento, CA, ABD	400-163
NEAA (NEAA)	Gibco, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri	T8787-100ML
Ultra düşük ataşmanlı T75 şişeler	Corning, Corning, NY, Amerika Birleşik Devletleri	3814

Serisi Serisi Serisi Serisi arası Serisi Serisi