1. Ventral orta beyin ve Omurilik Diseksiyonu
NOT: Floresan diseksiyon stereomikroskobu altında 1.1.1−1.1.3 ve 1.1.5−1.1.6 adımları dışında aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirin. Deney başına toplam diseksiyon süresi, diseksiyon tekniğindeki yeterliliğe ve her deney için gereken motor nöron sayısına bağlı olarak tipik olarak 3-5 saattir.
- Ventral orta beyin diseksiyonu
- Hamile bir fareyi döllenmeden yaklaşık 11.5 gün sonra karbondioksit gazı ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Karnı etanol ile iyice püskürtün ve steril mikro diseksiyon makası ve başparmak pansuman forseps kullanarak uterusu çıkarın. Uterusu steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kısa bir süre yıkayın, ardından önceden soğutulmuş steril PBS ile doldurulmuş diseksiyon plakasına aktarın.
- IslMN:GFP (Adacık motor nöron: yeşil floresan protein)-pozitif embriyoları, steril mikro diseksiyon makası, başparmak pansuman forseps ve Dumont # 5 cımbız kullanarak buz gibi steril steril steril fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak uterustan dikkatlice çıkarın. Steril bir Moria mini delikli kaşık kullanarak, her bir embriyoyu, 1x B27 ile desteklenmiş, önceden soğutulmuş Hibernate-E düşük floresan ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna aktarın. 24 kuyulu plakayı buz üzerinde tutun.
- Bir embriyoyu steril bir diseksiyon plakasına aktarın ve buz gibi steril Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile tamamen kaplayın.
- Diseksiyon adımlarının mikroskobun floresan izotiyosiyanat (FITC) aydınlatması altında gerçekleştirildiğinden emin olun. Cımbız kullanarak, orta beyne zarar vermeden embriyonun kuyruğunu ve yüzünü çıkarın (Şekil 1Ba). Embriyoyu, uzuvları altına yerleştirilmiş ve kuyruğu mikroskobun ön tarafına, disektöre doğru bakacak şekilde yüzüstü yerleştirin (bir yıldız işareti ile gösterilir, Şekil 1Bb).
- Cımbız kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için dördüncü ventrikülün çatısını yarın. Dördüncü ventrikül ile çatısı arasında oluşturulan boşluğa cımbız asmak için bu açıklığı kullanın. Embriyo rostralının dorsal yüzeyi boyunca kortekse ve taban plakasına ve motor kolona lateral olarak diseksiyon yapın (Şekil 1Ca, b). GFP pozitif okülomotor nöron (kraniyal sinir 3 [CN3]) ve troklear nöron (kraniyal sinir 4 [CN4]) çekirdeklerini ortaya çıkarmak için diseke edilen dokuyu açık kitap şeklinde açın.
NOT: Mezenşim, CN3 ve CN4 içeren ventral orta beyinden küçük bir doku parçası şimdi açığa çıkacaktır.
- Ventral orta beyni embriyodan dikkatlice ayırın ve cımbız ve mikro diseksiyon bıçağı kullanarak meningeal dokuyu çıkarın. Bilateral GFP pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini cımbız ve mikro diseksiyon bıçağı kullanarak zemin plakasından ve diğer GFP negatif çevre dokulardan uzaklaştırın (Şekil 1D). Eksize edilen dokudaki GFP pozitif motor nöronların sayısını en üst düzeye çıkarın, ancak bunlara dokunmaktan veya zarar vermekten kaçının.
- Ayrı CN3 ve CN4 çekirdeklerinden oluşan bir koleksiyon isteniyorsa, bu iki çekirdeğin orta hattı boyunca kesin (Şekil 1D'de sarı noktalı çizgi). Bir P1000 pipeti kullanarak, diseke edilmiş ventral orta beyin dokusunu minimal HBSS ile toplayın ve diseksiyon ortamı ile doldurulmuş etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Ayrışana kadar buz üzerinde saklayın.
- Toplam sayı deneysel gereksinimi karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral orta beyinleri bir araya getirmeye devam edin (ideal hücre sayıları için adım 4'e bakın).
NOT: Yaklaşık 1 x 104 CN3/CN4 motor nöron veren en az 10 ventral orta beyinden oluşan bir havuzlanmış koleksiyon önerilir, çünkü dokular ayrışma ve sıralama sırasında strese maruz kalır.
- Ventral omurilik diseksiyonu
- Embriyoyu, başı mikroskobun ön tarafına, disektöre doğru bakacak şekilde yüzüstü tutun. Embriyoyu bir cımbızla tutun ve diğer cımbız çiftinin ucunu dördüncü ventrikülün açılmamış kaudal kısmına yerleştirin.
- Arka beynin ve omuriliğin geri kalanını, embriyonun tüm rostrokaudal kapsamı boyunca dorsal olarak açın. Dördüncü ventrikülden başlayarak forsepsleri makas olarak kullanarak kaudal omuriliğin merkezi kanalına doğru ilerleyerek dorsal doku kesilerek açılır (Şekil 1Ca,b). Bu işlem sırasında ventral omuriliğe dokunmaktan veya zarar vermekten kaçınmaya dikkat edin.
- Embriyoyu bir cımbızla tutun ve diğer cımbızla her iki taraftaki sırt dokusunun flebini sıkıştırın (Şekil 1Ea,b).
NOT: Eksize edilen sırt dokuları dorsal deri, mezenşim, dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), dorsal arka beyin ve omurilik içerir. Spinal motor nöron (SMN) çekirdeklerine zarar vermeden bu dokuların mümkün olduğunca çoğunu çıkarın, çünkü bunlar yapışkandır ve filtreleme sırasında SMN'leri yakalayabilir veya floresanla aktive edilen Hücre Sıralama (FACS) sırasında tıkanmaya neden olabilir.
- GFP pozitif SMN'nin hemen altını delmek için mikrodiseksiyon bıçağını kullanarak ventral omuriliği çıkarın. Ventral omuriliği her iki taraftan testere benzeri hareketlerle kaldırın (Şekil 1Fa,b). Yüzen ventral omuriliği, ilk GFP pozitif ön boynuzun çıkıntı yaptığı C1'in hemen üzerinde enlemesine kesin (Şekil 1G). Ayrıca, alt ekstremitenin üst sınırında enine kesin (Şekil 1G). Bu işlemden sonra ventral omuriliğin servikal (C1)-lomber (L2-L3) kısmını çıkarın.
- Ventral omurilik dorsal tarafını yukarı yerleştirin ve GFP pozitif SMN kolonları arasındaki GFP negatif dokuyu bir cımbızla bastırarak tutun. GFP pozitif SMN kolonunun her iki tarafını mikrodiseksiyon bıçağıyla keserek kalan bağlı mezenşimi, DRG'leri ve dorsal omuriliği çıkarın (Şekil 1H). GFP pozitif motor nöronları zarar vermeden en üst düzeye çıkarmaya özen gösterin.
- Bir P1000 pipeti kullanarak, diseke edilmiş ventral omurilik dokusunu minimal HBSS ile toplayın ve diseksiyon ortamı ile doldurulmuş SMN etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Ayrışana kadar buz üzerinde saklayın. Toplam sayı deneysel gereksinimleri karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral omurilikleri birleştirmeye devam edin.
not: Yaklaşık 2.1 x 104 SMN veren en az üç ventral omuriliğin toplanması önerilir, çünkü dokular ayrışma ve sıralama sırasında strese maruz kalır.
- Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için sırasıyla GFP pozitif ve GFP negatif kontroller olarak IslMN: GFP fare embriyolarının fasiyal motor nöronlarını ve ekstremitelerini toplayın. Ekstremiteler GFP negatiftir, çünkü SMN'lerin GFP pozitif aksonları bu embriyonik yaşta henüz ekstremitelere yayılmamıştır.
2. Doku Ayrışması
NOT: Toplam ayrışma süresi tipik olarak deney başına 1,5 saattir.
- Ayrışmadan 30 dakika önce papain ve albümin-ovomokoid inhibitör solüsyonu alikotlarını 37 ° C'ye ısıtın.
- Mikro diseke edilmiş dokuları kısa bir süre düşük hızda döndürün.
- Bir P100 pipeti kullanarak, dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca çok Hibernate E'yi dikkatlice çıkarın.
NOT: Bir sonraki adımda papain ayrışmasının etkinliğini azaltmamak için bu adımdan sonra kalan tüm Hibernate E'yi çıkardığınızdan emin olun.
- Mikrodiseke doku örneklerini içeren 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinin her birine uygun hacimde papain solüsyonu (Tablo 1) ekleyin.
NOT: Hücreler üzerindeki stresi en aza indirirken etkili ayrışmayı en üst düzeye çıkarmak için ayrışma için uygun papain hacmi belirlenmiştir.
- Bir P8 pipetle 200x'i nazikçe ezin. Motor nöron canlılığını korumak için tüm tritürasyon adımlarını nazikçe gerçekleştirin.
- Dokuları içeren tüpleri 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin, her 10 dakikada bir 10 kez parmak hareketiyle çalkalayın. İnkübasyondan sonra her bir süspansiyonu 8x bir P200 pipeti ile nazikçe ezin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Bir sonraki adımda ovomoksoid inhibisyonunun etkinliğini sağlamak için, dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarmak ve atmak için bir P1000 pipeti kullanın.
- Peletleri uygun hacimde albümin-ovomokoid inhibitör çözeltisinde (Tablo 1) bir P8 pipeti ile 200x'i hafifçe ezerek yeniden süspanse edin.
- Kalan ayrışmamış doku parçalarının tüpün dibine çökmesine izin vermek için 2 dakika bekleyin.
- Bir P200 pipeti kullanarak ayrışmamış dokuları aspire etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatan toplayın. Süpernatanı taze 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Adım 2.10'dan sonra bazı doku parçaları ayrışmadan kalırsa, daha önce ayrışmış hücreler üzerindeki stresi en aza indirirken, daha önce ayrışmış hücreler üzerindeki stresi en aza indirmek için orijinal 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde kalan ayrışmamış dokular için 2.8-2.10 adımlarını tekrarlayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. Bir P1000 pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
- Bir P8 pipeti kullanarak 1000x pipetleyerek peleti uygun hacimde diseksiyon ortamında (Tablo 1) yeniden süspanse edin. Uygun nihai süspansiyon hacmi, hücre yoğunluğunun 107 hücre / mL'yi aşmaması için belirlendi, bu da akış sitometri makinesinin akışını bloke edebilir, aynı zamanda hücrelerin aşırı seyreltilmemesi için de yavaşlamış bir sıralama hızı ile sonuçlanır.
- Büyük topakları veya sindirilmemiş dokuları ortadan kaldırmak için süspansiyonları 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün. Süspansiyonları 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine aktarın ve gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın.
3. Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS)
>NOT: Bu protokol, 15 mw 405 nm mor lazer, 100 mw 488 nm mavi lazer, 75 mw 594 nm turuncu lazer ve 40 mw 640 nm kırmızı lazer ile donatılmış bir FACS sıralayıcı kullanılarak optimize edilmiştir. Hücreler, 100 μm'lik bir nozul aracılığıyla aseptik koşullar altında steril PBS'de kılıf sıvısı olarak sınıflandırıldı. Hücre stresini en aza indirmek için, akış hızı 1-3'lük bir numune basıncına ayarlandı, böylece saniyede maksimum 1.000-4.000 olay elde edildi. Toplam FACS süresi tipik olarak deney başına 1-2 saattir.
- Hücre popülasyonunun düzgün bir şekilde görselleştirilebilmesi için ileri ve yan saçılma için voltajları ayarlayın. Hücre sıralaması için uygun voltajların ayarlanması karmaşıktır ve deneyimli bir FACS operatörü gerektirir.
- Farklı hücre popülasyonlarını ayırt etmek için, hücreleri İleri Saçılma Alanı (FSC-A) tarafından belirlenen boyuta ve Yan Saçılma Alanı (SSC-A) tarafından belirlenen iç karmaşıklığa göre çizin. Kalıntıları ve ölü hücreleri dışlamak için Şekil 2Aa ve Şekil Ba'da gösterildiği gibi canlı hücrelerin etrafına bir kapı çizin. Geçitli bölge içindeki hücreleri popülasyon 1 (P1) olarak gruplandırın.
- Hücre kümelerini ve çiftlerini dışlamak için, SSC-A'ya karşı Yan Saçılma Genişliğine (SSC-W) dayalı olarak P1 hücrelerini çizin. Tek hücrelerin popülasyonunu popülasyon 2 (P2) olarak geçit (Şekil 2Ab ve Şekil Bb).
- FSC-A'ya karşı İleri Saçılma Genişliğine (FSC-W) dayalı olarak P2 hücrelerini çizin ve tek hücrelerin popülasyonunu popülasyon 3 (P3) olarak kapılayın (Şekil 2Ac ve Şekil Bc).
not: 3.3 ve 3.4'te iki ardışık kapının kullanılması, hücre kümelerini ve çiftlerini (yüksek FSC-W ve yüksek FSC-A) hariç tutar.
- Allofikosiyanin (APC) ye karşı GFP'ye dayalı kapı P3 hücreleri. APC kanalı otofloresanı algılar. Bu kanaldaki geçit, otofloresan hücrelerin yakalanmasını önler. FITC/GFP floresan kanallarının voltajını ayarlamak için GFP-negatif hücreler kullanın. İdeal olarak, bu hücre popülasyonları için kapıları 102 civarında konumlandırın. Her motor nöron tipi için GFP pozitif popülasyon 4 (P4) için ayrı ayrı kapı eşiklerini seçin (Şekil 2AD ve Şekil Bd).
NOT: Saf bir kültür elde etmek için SMN'ler için GFP kapısını CN3'ler/CN4'lerden çok daha yükseğe ayarlayın (Şekil 2AD ve Şekil Bd). SMN kültürleri için daha düşük bir GFP kapısı, kültürlerin glia ve motor olmayan nöronlar tarafından kontaminasyonuna yol açar. Bunun nedeni, sızdıran bir promotör nedeniyle bazı glia ve motor olmayan nöronlarda düşük seviyeli GFP ekspresyonu olmasıdır. Toplam hücrelere kıyasla GFP pozitif hücrelerin yüzdesi tipik olarak CN3'ler / CN4'ler için %0.5-1.5 ve SMN'ler için %1.5-2.5'tir. Diseksiyon başarılı olduysa, bu sayılar GFP-pozitif kapı için uygun pozisyonu belirlemek için bir kıyaslama olarak kullanılabilir (Şekil 2Ae ve Şekil Be).
- FACS'yi üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. P4 hücrelerini, 500 μL motor nöron kültürü ortamı ile doldurulmuş taze 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Kaplanana kadar buz üzerinde saklayın.
not: Hücreler doğrudan kuyucuklara ayrılabilse de, bu, kuyu başına eşit olmayan sayıda hücre ile sonuçlanır. Hücreleri 1.75 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine sıralayın ve daha eşit bir kaplama dağılımı elde etmek için manuel olarak plakalayın.
4. Saflaştırılmış Primer Motor Nöronların Kültürü
- FACS ile izole edilmiş CN3 / CN4 ve SMN süspansiyonlarını, sırasıyla 5 x 103 ve 1 x 104 hücre / mL yoğunluklara 37 ° C'ye önceden ısıtılmış motor nöron kültürü ortamı ile seyreltin.
not: Bir E11.5 embriyosu yaklaşık 1 x 103 CN3 / CN4 ve 7 x 103 SMN verir. Bununla birlikte, bu verimler büyük ölçüde diseke edilen dokuların saflığına, hücre ayrışmasının eksiksizliğine ve FACS sırasında GFP kapılarının uygun şekilde eşiklenmesine dayanır.
- Poli D-lizin (PDL) ve laminin ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakayı 37 °C doku kültürü inkübatöründen laminer akış başlığına aktarın ve her oyuktan laminini aspire edin. Tabakları ve lamelleri yıkamadan hemen kullanın.
- PDL / laminin kaplı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 200 μL seyreltilmiş CN3 / CN4 ve SMN süspansiyonları ekleyin. Nihai hücre yoğunlukları CN3/CN4 ve SMN için sırasıyla 1 x 103 ve 2 x 103 hücre/kuyu olmalıdır.
not: 96 oyuklu plakalarda (2 x 103 hücre/kuyucuk) SMN'lerin ilk kaplama yoğunluğu, 2 ve 9 günlük in vitro (DIV) (4−6 x 102 ve 2−4 x 10 2 hücre) benzer nihai motor nöron sayıları ve yoğunlukları elde etmek için CN3'lerin/CN4'lerin (1 x 103 hücre/kuyucuk) iki katıdır (4−6 x 102 hücre/kuyucuk) Sırasıyla).
- 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde kültür nöronları.
- Eski ortamın yarısını (100 μL) çıkararak ve aynı hacimde taze motor nöron kültür ortamı ile değiştirerek her 5 günde bir nöronları besleyin. Nöronal süreçlerin 1 DIV'de görünür hale geldiğinden ve 14 DIV'de daha kalın ve daha uzun hale geldiğinden emin olun (Şekil 3). Nöronal hücre gövdeleri genişler ve özellikle SMN'ler için uzun süreli kültürlerde toplanma eğilimindedir (Şekil 3).
NOT: Kültürlenmiş hücrelerin ayrılmasını önlemek için tüm ortam ve çözelti değişikliklerini orijinal ortam hacminin yarısını bırakarak gerçekleştirin. Buna fiksasyon ve immünositokimya (ICC) adımları dahildir. Tüm ortamlar çıkarılırsa, ne kadar nazikçe olursa olsun, hücrelerin çoğu ayrılacak ve yıkanacaktır.
