Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Fujiki, R., et al. Prenatal Isl^mn:GFP transgenik farelerden Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü. J. Vis. Uzm. (2019)

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Protokol

1. Ventral orta beyin ve Omurilik Diseksiyonu

NOT: Floresan diseksiyon stereomikroskobu altında 1.1.1−1.1.3 ve 1.1.5−1.1.6 adımları dışında aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirin. Deney başına toplam diseksiyon süresi, diseksiyon tekniğindeki yeterliliğe ve her deney için gereken motor nöron sayısına bağlı olarak tipik olarak 3-5 saattir.

1. Ventral orta beyin diseksiyonu
   1. Hamile bir fareyi döllenmeden yaklaşık 11.5 gün sonra karbondioksit gazı ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   2. Karnı etanol ile iyice püskürtün ve steril mikro diseksiyon makası ve başparmak pansuman forse....

Sonuçlar

Tablo 1: Dissosiyasyon adımlarında kullanılan uygun hacimlerde papain, albümin-ovomukoid ve son süspansiyon. Çeşitli sayıda ventral orta beyin ve ventral omurilik dokusu ile kullanılacak uygun papain ve albümin-ovomukoid hacimleri, birkaç tur optimizasyondan sonra üreticinin talimatlarından modifiye edildi. Dokular ayrışma ve sıralama sırasında strese maruz kaldığından, 10'dan fazla ventral orta beyin ve üçten fazla ventral omurilikten oluşan havuzlanmış bir koleksiyon önerilir. Papain hacmi, etkili diss.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B27 Takviyesi (50X), serum içermez	Thermo Fisher Bilimsel	17504-044
BD FACSAria llu SORP Akış Sitometresi	BD Biyobilim	-	Bu, 405, 488, 594 ve 640 nm lazerlerle donatılmış 4 lazer sistemine sahiptir.
BD Falcon 70μm Naylon Hücreli Süzgeçler	Corning	352350	FACS'tan önce ayrışan hücreleri filtrelemek için.
BD Falcon Geçmeli Kapaklı Yuvarlak Alt Test Tüpleri	Corning	352054
BDNF İnsan	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-207 Serisi
Hücre Kültürü mikroplakası, 96 kuyulu, PS, F-dipli (Baca Kuyusu)	Greiner Bio-One Uluslararası	655090	Birden fazla 96 kuyulu yemek denedik ve bu, ICC'den sonra kültür ve analizler için en iyisiydi
CNTF İnsan	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-272 Serisi
4 ",6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI)	Thermo Fisher Bilimsel	D1306
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich	D2650	DMSO (Türkçe)
Dumont #5 Forseps Inox Uç Boyutu .05 x .01 mm Biologie İpuçları	Roboz Cerrahi Alet	RS-5015
Forskolin	Thermo Fisher Bilimsel	BP25205
GDNF İnsan	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-305 Serisi
GlutaMAX takviyesi	Thermo Fisher Bilimsel	35050-061
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Thermo Fisher Bilimsel	14175-095
Hazırda Bekletme E	Beyin Bitleri	o
Hazırda bekletme E düşük floresan	Beyin Bitleri	HELF (HELF)	Embriyonun GFP ekspresyonlarının gözlenmesini engelleyen floresan düşük olmalıdır.
At serumu, ısı inaktive edilmiş, Yeni Zelanda menşeli	Thermo Fisher Bilimsel	26050-070
IBM Bilişim Teknolojileri	Tocris Aşçı	2845	İzobutilmetilksantin
Laminin	Thermo Fisher Bilimsel	23017-015
Leibovitz'in L15 ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	11415064
2-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Mikro Diseksiyon Makası	Roboz Cerrahi Alet	RS-5913
Mikro Bıçak, 4,75" 1,7 x 27 mm bıçak	Roboz Cerrahi Alet	RS-6272
Moria Mini Delikli Kaşık	Güzel Bilim Araçları	10370-19
Olympus 1.7ml Mikrotüpler, Şeffaf	Genesee Bilimsel	22-281	Bunlar, bağlamda "1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri" olarak tanımladığımız tüplerdir.
Papain Ayrışma Sistemi	Worthington Biyokimya A.Ş.	LK003150	Papain çözeltisi ve alubumin-ovomukoid inhibitör çözeltisi bu kitten hazırlanır.
Penisilin-streptomisin (10.000 U / ml)	Thermo Fisher Bilimsel	15140-122
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Thermo Fisher Bilimsel	10010-023
Poli D-lizin (PDL)	MilliporeSigma	A-003-E
DS-Ri1 kameralı SMZ18 ve SMZ1500 zoom stereomikroskoplar	Nikon	-	Diseksiyon yapıldı ve bu floresan mikroskoplar altında diseke edilen embriyo ve dokuların görüntüleri alındı.
Sylgard 170 Siyah Silikon Kapsülleyici - A+B 0.9 Kg kit	Dow Corning	1696157	Bu kiti kullanarak diseksiyon yemekleri yapıyoruz.
TC ile işlenmiş Tabaklar, 100 x 20 mm	Genesee Bilimsel	25-202	Bu yemeği kullanarak diseksiyon yemekleri yapıyoruz.
Tampon Pansuman Forseps 4.5" Tırtıklı 2.2 mm Uç Genişliği	Roboz Cerrahi Alet	RS-8100
Zeiss LSM 700 serisi lazer taramalı konfokal mikroskop ve Zen Yazılımı	Carl Zeiss	-	Bu ekipmanlarla embriyonun konfokal görüntüsü alındı

Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi arası arası Serisi ·