Bir Hücre Üretim Tesisinde Nöronal Kök Hücre Kültürlerinin İşlenmesi

Özet

Kaynak: Stover, A. E., et al,. Temel ve klinik öncesi araştırmalar için kapalı bir hücre kültürü sisteminde insan pluripotent ve nöral kök hücrelerinin kültürlenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Video, nöronal kök hücrelerin büyümesi ve sürdürülmesi için bir hücre kültürü iş istasyonunda kontrollü bir ortamın sürdürülmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu prosedürler, oda koşullarının ayarlanmasını, temizleme protokollerini ve ortam hazırlığını içerir, böylece maksimum sterilite ve tekrarlanabilirliğin korunmasını ve geleneksel yöntemlerin değiştirilmesini içerir.

Protokol

1. İlk Kurulum

1. Gaz ve Sıcaklık Konsantrasyonlarının Ayarlanması
   1. Yazılımı kullanarak, grafik arayüzün sol üst köşesindeki "Misafir" sekmesine tıklayın. Belirlenmiş bir kullanıcı adı ve şifre kullanarak sisteme giriş yapın. Her kullanıcının kendi kullanıcı adı ve şifresi olduğundan emin olun.
   2. Ayarlamak için bir modüle tıklayın (Şekil 1). Mevcut ayarları gösteren yeni pencerede, "Ayar noktası"nın altındaki mevcut O₂ ayar noktası değerine tıklayın ve bu modülün gerekli O₂ konsantrasyon seviyesini girin. Bu modülde pluripotent kök hücreler büyütülecek veya manipüle edilecekse %5_O2, nöral kök hücreler büyütülecek veya manipüle edilecekse %9_O2 girin. Ayar noktasını onaylamak için yeşil onay işaretine tıklayın.
      not: İki modül gazla ayarlanamaz: laminer başlık ve mikroskop odası. Laminer akış başlığındaki gaz konsantrasyonları atmosferiktir, proses odasındakiler ise mikroskop odasındakileri pasif olarak korur.
   3. CO₂ için bu adımı tekrarlayın. Yalnızca O_2'ye ayarlanan tampon odaları dışındaki tüm modüller için %5 CO_2'lik bir ayar noktası girin.
   4. Yeni ayar noktalarına ulaştıklarından emin olmak için "proses değerleri" etiketli mevcut gaz konsantrasyonlarını izleyin.
   5. Tüm modüllerin gaz ayar noktalarını uygun değerlere ayarlayın. Birbirine maruz kalacak odaların CO₂ ve O₂ seviyelerini eşleştirin. Örneğin, hücreleri %5_O2'de büyüten bir inkübatörü açmadan önce işlem odasını %5_O2'ye ayarlayın. Ayrıca, bu süre zarfında işlem odasına öğe eklemek için kullanılan herhangi bir tampon odasında %5 O_2'ye değiştirin.
   6. Gaz ayarlamaları için aynı ekranı kullanarak proses odasının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. Ayrıca, proses odası zemin sıcaklığı 37 °C'ye ayarlanmalıdır.
   7. Her inkübatörün altındaki inkübasyon modülü bankalarına tıklayın. Bankların sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
2. Tampon Odalarının İşleyişi
   1. İş akışında gecikmeyi önlemek için verilen görev için gerekli tüm malzemeleri (besleme, bölme, boyama vb.) başlangıçta toplayın. Tüm malzemelere bolca %70 etanol püskürtün ve laminer başlıkta kurumaya bırakın. Şişelere veya hücre plakalarına püskürtmeyin - bunları %70 etanol ile doyurulmuş steril bir gazlı bez süngerle nazikçe silin.
   2. Tampon odasının dış ve iç kapılarının güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun. Ardından dış kapıyı açın ve eşyaları içine yerleştirin.
   3. Dış kapıyı kapatın. Yazılım içinde tampon modülünü seçin ve seyreltme faktörü sekmesine tıklayın. Günlük faktörü kutusuna bir tane girin. start.
      tıklayın Not: Bir "seyreltme faktörü", tampon modülünün atmosferinin boşaltılacağı ve bir kez temiz, HEPA ile filtrelenmiş gazla değiştirileceği anlamına gelir.
   4. Grafik arayüzün "seyreltme faktörü" yanıp sönmesi durduğunda, tampon odasının iç kapağını açın ve malzemeleri işlem odasının içine getirin.
      Dikkat: İç ve dış kapıların aynı anda açılmasına izin vermeyin ve tampon odası bir seyreltme faktörüne maruz kalmamışsa iç kapağı açmayın.
   5. İlk olarak, öğeleri işlem odasından çıkarın ve tampon odasının bir seyreltme faktörüne maruz kaldığından emin olun. Ardından iç kapıyı açın, çıkarılacak eşyaları içeriye yerleştirin ve iç kapıyı kapatın. Ardından dış kapıyı açın ve öğeleri çıkarın.
      Not: Dış kapı açılmadan önce bir seyreltme faktörü çalıştırılmamalıdır.

2. Hücrelerin Tanıtılması ve Beslenmesi

1. Kuluçka Makinesi Kurulumu
   1. Her inkübatörün tabanındaki su kabına 3 Petri kabı yerleştirin. Bu bulaşıkları doğrudan tavayı doldurmayın, steril suyla doldurun. İnkübatörlerin bağıl nem (RH) ayar noktasını korumak için kritik öneme sahip oldukları için bu kaplardaki su seviyesini koruyun.
   2. Grafik arayüz içinde, inkübatöre tıklayın. Ayar noktası altında, mevcut bağıl nem (RH) değerine tıklayın ve %85 girin. Bu değeri kabul etmek için yeşil onay işaretine tıklayın.
2. Hücre Üretim Tesisinin Hücreler İçin Hazırlanması
   1. Henüz yapılmadıysa, tampon odalarını, işlem odasını ve bir inkübatörü, tanıtılan hücre tipi için gereken gaz ayar noktalarına ayarlayın.
   2. İşlem odasının yüzeyini steril gazlı bez ve yanıcı olmayan bir dezenfektan ile temizleyin. Perasetik asit bazlı dezenfektan kullanmayın; Kapalı bir sistemde, güçlü, kalıcı buharlar memeli hücreleri için toksiktir. Bunun yerine benzalkonyum klorür bazlı ürünler kullanın.
   3. Dezenfekte etmeye devam edin. Eldivenleri ve kapı kolları gibi sık dokunulan yüzeyleri temizleyin. Dezenfektanı iyice ama idareli kullanın, çünkü işlem odasındaki fazla sıvı neme, yoğuşmaya ve olası mikrobiyal büyümeye katkıda bulunacaktır.
   4. Laminer akış başlığının ve tampon odasının yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve kurumasını bekleyin. Şişeyi veya hücre plakasını (bizim durumumuzda, PSC'ler (pluripotent kök hücreler) veya NSC'ler (nöral kök hücreler)) kaputun içine yerleştirin ve dış yüzeyini etanol ile doyurulmuş steril bir gazlı bez süngerle kısa bir süre silin.
   5. Şişeyi veya plakayı tampon haznesine koyun ve bir seyreltme faktörü çalıştırın (adım 1.2.3).
   6. Seyreltme faktörünün tamamlanmasının ardından, şişeyi veya plakayı hemen uygun inkübatöre taşıyın. İnkübatörler işlem odasının arkasında olduğundan, hücre yerleştirme için işlem odasına bir raf çekin. İşlem odasının havası inkübatörlerinkine kıyasla çok kuru olduğundan ve inkübatörde önemli bir nem kaybına neden olacağından, inkübatör kapılarını gereksiz yere veya uzun süre açmaktan kaçının.
3. Hücre Kültürlerinin Beslenmesi
   1. Serolojik pipetler, elektronik pipetleyici, gazlı bez ve dezenfektan gibi orta bileşenleri toplayın. Ayrıca, kullanılmış hücre kültürü ortamı için bir atık kabı toplayın, ancak ağartıcı ile doldurmayın. Malzemeleri, Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi bir tampon odasından proses odasına getirin. Optimum bir çalışma alanı sağlamak için malzemeleri düzenleyin. Kullanılmayan eşyaları işlem odasının ortasına yerleştirmekten kaçının.
   2. Ortamın sistemde bulunan CO₂ ve O₂ seviyeleri ile dengelenmesine izin vermek için medya kabını hafifçe açık bırakın. Bazı PSC ortam üreticileri, ortamın 37 ºC'de ısıtılmamasını belirtir; Eğer öyleyse, ortamı dengelemek için bir tampon odası kullanın. Ortamın 20 dakika dengelenmesine izin verin.
   3. Uygun bir stereolojik pipet ve elektronik pipetleyici kullanarak eski ortamı kuyulardan çıkarın. PSC'ler için, besleme işlemi sırasında kurumayı önlemek için eski ortamın kalan küçük bir miktarı dışında tamamını çıkarın. NSC'ler için eski ortamın yarısını çıkarın. Atıkları atık kabına pipetleyin.
   4. Kullanılmış pipeti orijinal ambalajına geri yerleştirin ve işlem odasının yan tarafına veya atıkların uzaklaştırılması için tasarlanmış bir tampon odasına taşıyın. Taze steril bir serolojik pipet ile hücre kültürü plakalarına taze besiyeri ekleyin ve plakaları belirlenen inkübatörlerine geri yerleştirin.
   5. Beslemenin sonunda, gazlı beze dezenfektan püskürtün ve işlem odasının zeminini ve kapı kollarını iyice temizleyin. Sistemde birden fazla hücre hattı büyütülüyorsa, her bir hücre hattını beslemek arasında sterilize edin. Bu, çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmeye yardımcı olur.
   6. Tamamlandıktan sonra atıkları veya diğer gereksiz öğeleri tampon odalarından birinden çıkarın.

3. Hücre Kültürlerini Bölme

1. PSC'lerin veya NSC'lerin Enzimatik Geçişi
   1. Geçiş için gereken tüm öğeleri toplayın. Buna ortam, enzim veya enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponu (ikincisi yalnızca NSC'ler içindir), DPBS (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini), plakalar veya şişeler, hücre dışı matris (ECM), konik tüpler ve serolojik pipetler dahildir. Bir tampon odası kullanarak bunları sisteme getirin.
   2. Yeni tabakları veya şişeleri daha önce açıklandığı gibi ECM ile kaplayın 9,10. Fare sarkomu hücre hatlarından türetilenler gibi bazı ECM'ler yalnızca 4 ila 15 °C arasında sıvıdır, bu nedenle ısıtılmış işlem odasında çalışırken ECM'yi soğuk tutmak için sterilize edilmiş bir soğuk blok veya jel buz torbası kullanın.
   3. Kullanılmış ortamı kültürden pipetleyin ve atık kabına atın.
   4. Kuyu veya şişe yüzeyini 1 ml DPBS/kuyu kullanarak durulayın ve DPBS'yi atın.
   5. Her oyuğa 1-2 ml ılık enzim ekleyin. Sadece çok yoğun kültürler 2 ml gerektirir.
   6. Kültür kabını veya şişeyi hemen mikroskop odasına taşıyın ve kültürü gözlemleyin. Tek tek hücrelerin tabaktan gevşemeye başladığına dair işaretlere dikkat edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce hücrelerin askıya alınmasını beklemeyin.
   7. Hücreleri ana işlem odasına geri koyun. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, her 1 ml enzim için 4 ml DPBS ekleyin ve ardından hücreleri kuyu yüzeyinden çıkarmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Çok duvarlı bir plaka içinde birden fazla kuyudan geçiyorsanız, hücreleri tek tek kuyucuklardan çıkarmadan önce DPBS'yi her bir kuyucuğa ekleyin.
   8. Enzimi ve PBS hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir konik tüpe aktarın.
   9. Hücre üretim tesisinde bir santrifüj yoksa, konik boruyu sıkıca kapatın, bir tampon odasına yerleştirin ve kapıyı kapatın.
   10. Konik tüpü tampon odasından laminer akış tarafından çıkarın ve hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
   11. Konik boruya %70 etanol püskürtün ve bir tampon odası ve seyreltme faktörü kullanarak işlem odasına getirin.
   12. Süpernatanı pipetleyin ve hücreleri 2 ml PSC veya NSC ortamında yeniden süspanse edin. PSC'leri geçiriyorsanız, ortama 10 μM'lik bir konsantrasyonda ROCK (Rho ile ilişkili protein kinaz) inhibitörü ekleyin.
   13. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve gerekli kuyucukları veya plakaları belirleyin. 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ hücre/cm^2'de plaka PSC'leri. NSC'leri 1:2 oranında bölün.
       Not: NSC'ler genellikle bir hemositometrede toplanır ve doğru sayıma direnir.
   14. Hücrelerin dondurularak saklanması gerekiyorsa, tüm sarf malzemelerinin ve dondurma ortamının hazırlandığından ve işlem odasının içine yerleştirildiğinden emin olun. DMSO (Dimetilsülfoksit) 37 ºC'de hücreler için çok toksiktir, bu nedenle hızlı çalışır. İzopropanol ceketli dondurma kabını laminer akış başlığında RT'de tutun. Kriyoprezervasyon şişeleri doldurulduktan ve kapatıldıktan sonra, bunları bir tampon odasından geçirerek hemen işlem odasından çıkarın.
2. PSC'lerin manuel olarak geçirilmesi
   1. Daha önce açıklandığı gibi kültürün geçirilmesi gerektiğini onaylayın. Eğer öyleyse, hücre dışı matris ile kaplanmış taze plakalar veya şişeler hazırlayın. Ardından, ortamı tamamen değiştirin.
   2. Mikroskop haznesini, az miktarda yanıcı olmayan dezenfektanla nemlendirilmiş steril gazlı bezle temizleyin - çok fazla buğulanmaya neden olur. Sadece eldivenleri, zemin alanını ve sahneyi temizleyin. Birkaç 200 μl veya 1.000 μl ayrı ayrı sarılmış pipet ucunu hazneye getirin.
   3. PSC plakasını mikroskop odasına getirin, kapağı çıkarın ve yeni temizlenmiş zemine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Kapağı yukarıda bırakmak, alt tarafı doğrudan hava akımlarına ve olası kirlenmeye maruz bırakır.
   4. Bir pipet ucunu açın ve kültürü görselleştirmek için mikroskobu kullanarak, pipetin ucunu kullanarak iyi morfolojiye sahip kolonileri ayırın.
      Not: Bireysel kullanıcı bunu daha rahat bulursa, pipet ucu bir pipete takılabilir.
   5. Plakanın kapağını yerine takın ve plakayı işlem odasına geri taşıyın.
   6. Yeni plakadaki fazla ECM'yi pipetleyin ve ortamı eski plakadan (süspansiyon halindeki koloni parçalarını içeren) yeni plakaya aktarın. Eski tabak hala toplanmaya hazır olmayan koloniler içeriyorsa, onları da besleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. Hücre üretim tesisi için grafiksel arayüz. (A) CPF'nin grafiksel gösterimi varsayılan ekrandır ve Şekil 3'te gösterilen CAD çizimiyle eşleşir. Tampon Modül 1 üzerine bir fare tıklaması, O₂ değerlerinin işlem odasıyla eşleşecek şekilde ayarlandığı kontrol ekranını (B) açar. Benzer şekilde, İşlem Odası veya İnkübatör 1'e tıklamak, değerlerin uygun şe...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Xvivo Sistemi	Biyosferik	ısmarlama
Xvivo Yazılımı	Biyosferik	Sürüm i.o.2.1.2.1
O2 Manifoldu	Amico Belediyesi	P-M2H-C3-S-U-OKSI
CO2 Manifoldu	Amico Belediyesi	M2H-C3-D-U-CO2
N2 Manifoldu	Batılı Yenilikçi	CTM75-7-2-2-BM
O2 Gazı
CO2 Gazı
N2 Gazı
Petri kabı
Su
Steril gazlı bez
% 70 etanol	BDH (Türkçe)	BDH1164-4LP
Benzalkonyum Klorür Bazlı Dezenfektan
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu
Hank'in Hücre Ayrışma Tamponu	Yaşam Teknolojileri	13150-016
2 mL Serolojik pipet	VWR (VWR)	89130-894
5 mL Serolojik pipet	Olympus Plastik	12-102
10 mL Serolojik pipet	Olympus Plastik	12-104
25 mL Serolojik pipet	Olympus Plastik	12-106
50 mL Serolojik pipet	Olympus Plastik	12-107
6 oyuklu plaka	Corning	353046
20 uL pipet uçları	Eppendorf Belediyesi	22491130
200uL pipet uçları	Eppendorf Belediyesi	22491148
1000 pipet ucu	Eppendorf Belediyesi	22491156
DP21 kameralı ve floresan mikroskop	Olimpos Şirketi	CKX41
Fosfat Tamponlu Sodyum	Klon	9236
Dimetil sülfoksit	Gelgit	PP1130
eldivenler

arası arası arası arası Serisi Serisi