$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hattı, HPS1006, MEXT/ AMED, Japonya'nın Ulusal Biyo-Kaynak Projesi aracılığıyla RIKEN BRC tarafından sağlanmıştır.
1. Endotelyal progenitör hücrelere (EPC'ler) hiPSC farklılaşmasının indüksiyonu
- Hücre dışı matris (ECM) kaplı plakalar ve reaktifler
- -20 ° C'de 6 aya kadar saklamak için 50 mL santrifüj tüplerine 2,5 mg matris jeli alikode ederek bazal membran matris kaplı 12 oyuklu plakalar hazırlayın. Buzdolabında (4 °C) bekletilen 30 mL soğuk Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta/besin karışımı F-12'yi (DMEM/F12) tüpe ekleyin. Jel çözülene kadar pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 μL çözelti ekleyin. Plakayı en az 1 h.
için bir inkübatöre (37 °C, %5 CO2) yerleştirin
not: Bodrum membran matris jeli sıcaklığa duyarlıdır ve üreticinin alikotasyon ve plaka kaplama talimatlarına göre ele alınmalıdır. Hücre dışı matriks proteinlerinin konsantrasyonu partiler arasında değişebilir. Doğruluğu sağlamak için, lot numarası kullanılarak belirli parti için kalite sertifika sayfasında tam konsantrasyona atıfta bulunulmalıdır. Örneğin, tam konsantrasyon 10.0 mg / mL ise, toplam 2.5 mg için 250 μL jel kullanın.
- ROCK inhibitörünü steril suda 10 mM'lik bir konsantrasyona çözerek rho-kinaz (ROCK) inhibitörü stok çözeltisini hazırlayın (Tablo 1). Stok çözeltisini 100-200 μL'lik hacimlerde ayırın ve donma-çözülme döngülerini önlemek için -20 °C'de saklayın.
- 5 g L-askorbik asidi 50 mL steril suda çözerek 100 mg / mL'lik bir L-askorbik asit stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın (Tablo 1). Bir LaSR ortamı yapmak için 500 mL gelişmiş DMEM / F12'ye 6.25 mL glutamin ve 305 μL L-askorbik asit stok çözeltisi ekleyin (Tablo 1). 2-8 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- CHIR99021 seyreltilmemiş dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözerek CHIR99021 çözelti hazırlayın (Tablo 1). Donma-çözülme döngülerini önlemek için çözeltiyi 100-200 μL'lik hacimlere ayırın ve 1 yıla kadar -20 ° C'de saklayın. Stok çözeltisinin çalışma ürünlerini 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
- 450 mL DMEM / F12'ye 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ekleyerek DMEM / F12-10 ortamını hazırlayın. Ortamı 2-8 °C'de 1 aya kadar saklayın (Tablo 1).
- 467 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (PBS) 33.3 mL% 7.5 sığır serum albümini (BSA) ekleyerek akış tamponu-1'i hazırlayın (Tablo 1). 2-8 °C'de 6 aya kadar saklayın.
- Tekilleştirilmiş hiPSC'lerin tohumlanması ve EPC farklılaşması için genişleme (Gün -3 ila Gün -1)
- 6 oyuklu bir plakadaki hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşma göstermediğinde ve geçiş için uygun yoğunluğa sahip olduğunda, tipik olarak yaklaşık% 80 birleşme (2.5-3.5 x 106 hücre) olduğunda farklılaşmaya başlayın. Farklılaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için birden fazla geçişin gerekip gerekmediğinden emin olmak için kendiliğinden farklılaşmış hücreleri mikroskop altında dikkatlice izleyin. Hücre kültürü ortamı ve hücre dışı matris ile ilgili bilgi için aşağıda adım 1.4.15'te verilen nota bakın.
- Ortamı aspire edin ve kuyucuklara 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin. Ayrışma reaktif çözeltisini kuyucukların yüzeylerine iki veya üç kez nazikçe pipetleyerek hücreleri ayrıştırın ve tekilleştirin.
- Ayrılan hücreleri 4 mL hiPSC bakım ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri iyice yeniden süspanse edin. Hücre sayımı için 10 μL'lik bir alikot ayırın.
- Hücreleri 20-25 ° C'de 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Hücreleri sayın ve bazal membran matris kaplı 12 oyuklu plakada (adım 1.1.1) uygun bir hiPSC yoğunluğu (oyuk başına 75-400 x10 3) elde etmek için gereken hacmi hesaplayın.
- Kaplama solüsyonunu kuyucuklardan aspire edin ve her oyuğa 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL hiPSC ortamı ekleyin (1:1.000 seyreltme). Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL hiPSC ortamında ayırın.
- Adım 1.2.4'te belirlenen gerekli hiPSC hacmini 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ekleyin. Bir hiPSC klonunu ayırt etmek için iki ila dört adet 12 oyuklu plaka yeterli olabilir. Hücreleri tohumlamak için gereken plaka sayısını belirlemek için adım 1.2.4'e bakın.
- Plakayı bir inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2). Plakayı inkübatörde hafifçe ileri geri ve ardından yan yana kaydırarak hücreleri eşit şekilde dağıtın.
- Ertesi gün (ör. Gün -2), ortamı ROCK inhibitörü olmayan 2 mL hiPSC bakım ortamı ile değiştirin. Ertesi gün (Gün -1), besiyerini 2 mL taze hiPSC bakım besiyeri ile değiştirin.
- Glikojen sentaz kinaz 3 (GSK-3) inhibitörü CHIR99021 ile EPC'lerin indüksiyonu (Gün 0 - Gün 5)
- 0. Günde, her kuyucuktaki hiPSC bakım ortamını 8 μM CHIR99021 içeren 2 mL LaSR ortamı ile değiştirin.
- 1. Günde, ortamı aspire edin ve 8 μM CHIR99021 içeren 2 mL taze LaSR ortamı ekleyin.
- 2, 3 ve 4. günlerde, ortamı CHIR99021 içermeyen 2 mL taze LaSR ortamı ile değiştirin.
- CD31+ EPC'leri saflaştırmak için manyetik aktif hücre sınıflandırma (MACS) (5. Gün)
- 5. Günde, ortamı aspire edin ve ardından 37 ° C'de 6-8 dakika inkübe etmeden önce her oyuğa 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin.
- Hücreleri bir mikropipet ile ayırın ve tekilleştirin ve süspansiyonu 10 mL DMEM / F12-10 ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpe filtrelemek için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. İkiden fazla 12 oyuklu plakadan toplanan hücre süspansiyonunu en az iki 50 mL'lik tüpe süzün.
- DMEM / F12-10 ortamı (50 mL'ye kadar) ekleyerek sindirim reaksiyonunu durdurun. İyice pipetleyin ve hücreleri saymak için 10 μL ayırın. Hücreleri 20-25 ° C'de 200 x g'de 5 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
- Süpernatanı çıkardıktan sonra, 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu taze 15 mL tüplere aktarın. Hücreleri 20-25 ° C'de 200 x g'de 5 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve 100 μL tampon başına 1.0 x 107 hücre yoğunluğunda akış tamponu-1'e yeniden süspanse edin.
- 1:100 oranında Fc reseptörü (FcR) bloke edici reaktif ekleyin ve 1:200 oranında seyreltilmiş floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli CD31 antikorunu eklemeden önce 5 dakika inkübe edin. Süspansiyonu karanlıkta 20-25 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- CD31+ hücrelerinin fraksiyonunu belirlemek için akış sitometrisi analizi için 10 μL süspansiyon ayırarak 10 mL akış tamponu-1 ekleyin (Şekil 1).
- Hücreleri 20-25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve 100 μL akış tamponu-1 çözeltisi başına 1.0 x10 7 hücre yoğunluğuna yeniden süspanse edin. FITC seçim kokteylini ekleyin (100 μL hücre süspansiyonu başına 5 μL). Pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 20-25 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- 100 μL hücre süspansiyonu başına 5 μL manyetik nanopartikül ekleyin, iyice pipetleyin ve karanlıkta 20-25 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir akış sitometri tüpüne aktarın ve toplam 2.5 mL'lik bir hacim elde etmek için akış tamponu-1 ekleyin. Akış sitometri tüpünü 5 dakika boyunca mıknatısın içine yerleştirin.
- Sürekli bir hareketle, mıknatısı ters çevirin ve FITC-CD31 antikoru ile etiketlenmemiş hücreleri içeren hücre süspansiyonunu boşaltın. Mıknatısı ve tüpü 2-3 saniye ters konumda tutun ve ardından kalan sıvıyı çıkarın. Tüpü dik konuma getirmeden önce tüp kenarındaki damlacıkları aspire edin.
- Akış sitometri tüpünü mıknatıstan alın ve kalan CD31 + hücrelerini yıkamak için 2,5 mL akış tamponu-1 ekleyin. Hücreleri iki veya üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Akış tüpünü 5 dakika boyunca mıknatısın içine yerleştirin.
- Toplam dört yıkama için 1.4.11-1.4.12 adımlarını üç kez ve ardından 1.4.11 adımını bir kez daha tekrarlayın.
- Akış tüpünü mıknatıstan çıkarın ve saflaştırılmış CD31 + hücrelerini yeniden süspanse etmek için tüpe belirtilen miktarda uygun bir ortam (örneğin, genişletilmiş EC kültürü için insan endotel serumsuz ortamı [hECSR] veya dondurma için dondurma ortamı) ekleyin. Süspansiyonun iki adet 10 μL'lik alikotunu, biri hücre sayımı için ve ikincisi MACS sonrası numunelerde CD31+ hücrelerinin saflığını değerlendirmek için akış sitometrisi analizi yapmak için ayırın (Şekil 1). Bir akış sitometresi hemen mevcut değilse, alikotu analize kadar 4 ° C'de saklayın.
- Bu noktada CD31+ EPC'leri dondurun.
not: Vitronektin kaplı 12 oyuklu plakalar ve daha kararlı hiPSC bakım ortamı (mTeSR plus), bazal membran matris kaplı plakalar ve hiPSC bakım ortamı (mTeSR1) yerine kullanılabilir. Vitronektin kaplı 12 oyuklu plakaları hazırlamak için, vitronektini seyreltme tamponu ile 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve ardından seyreltilmiş çözeltinin 500 μL'sini 12 oyuklu plakaların her bir oyuğuna aktarın. Plakaları 20-25 °C'de en az 1 saat bekletin. Tekilleştirilmiş hiPSC'lerin tohumlama yoğunluğu, bazal membran matris kaplı plakalar için kullanılanla karşılaştırılabilir. Kültür ortamının veya matris bileşiminin değiştirilmesi, yeni kültür koşullarına uyum sağlamak için tipik olarak 1-2 hafta gerektiren hiPSC'lerin proliferasyonunu ve spontan farklılaşmasını etkileyebilir. hiPSC bakımı için daha kararlı hiPSC bakım ortamı kullanılıyorsa, bu ortam EPC farklılaştırması için hiPSC bakım ortamı yerine kullanılabilir. Bu durumda, ROCK inhibitörünü çıkarmak için daha kararlı olan hiPSC bakım ortamı -2. günde değiştirilmelidir ve -1. gündeki değişim atlanabilir.