$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Stok ortamı hazırlama ve kök hücre geri kazanımı
- 1.1.1.-1.1.5 adımlarında reaktifleri birleştirerek kültür ortamı stoğunu (DFHGPS) hazırlayın.
- Yüksek glikoz ve L-glutamin (D) içeren 210 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu ekleyin. 4 °C'de saklayın.
- L-glutamin takviyesi (F) ile 70 mL Ham's F12 Besin karışımı ekleyin. 4 °C'de saklayın.
- 4,2 mL 15 mM HEPES Tamponu (H) ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
- 4.2 mL% 10 D-glikoz Çözeltisi (G) ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
- 2.88 mL penisilin / streptomisin (PS) çözeltisi ekleyin. Stok çözeltisini 3 mL'lik alikotlara ayırın ve alikotları ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
not: Ortamdaki nihai penisilin konsantrasyonu 100 birim / mL ve streptomisin konsantrasyonu 100 μg / mL olacaktır. Bu ortam, protokolün geri kalanı için DFHGPS olarak adlandırılacaktır ve 1-2 hafta içinde kullanım için 4 ° C'de saklanmalıdır. Gerekirse, DFHGPS orantılı olarak ölçeklendirilebilir.
- Hücrelerin geri kazanılmasından bir gün önce, bir T75 şişesini, hNSC hücre hattının önceki kültürlerinden elde edilen 5 mL şartlandırılmış ortamla kaplayın ve gece boyunca% 8.5 karbondioksit (CO2) içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde bırakın.
not: Şu anda hNSC'leri kültürlüyorsanız, bir ortam değişikliği sırasında hücrelerin büyüdüğü ortamı kaydedin. Bu, hücreler tarafından "koşullandırıldığı" için şartlandırılmış bir ortamdır. Şartlandırılmış ortam, vidalı kapaklı bir tüpte saklanabilir ve yaklaşık 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir. hNSC'leri almak için sorumlu yazarla iletişime geçin. Şartlandırılmış ortam tercih edilir, ancak özellikle hNSC'lerin kültürüne ilk kez başlarken kesinlikle gerekli değildir.
- İyileşme gününde, 37 ° C'lik bir su banyosunda 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpte 20 mL DFHGPS'yi en az 10 dakika ısıtın ve kullanıma hazır olana kadar su banyosunda tutun.
- Ayrı bir 15 mL vidalı kapaklı tüpte, 10 mL DFHGPS'yi 37 ° C'lik bir su banyosunda en az 10 dakika ısıtın ve adım 1.13'te kullanıma hazır olana kadar su banyosunda tutun.
- Bir buz kabı ve tüm orta bileşenleri alın (Tablo 1). Tüm orta bileşenleri buz üzerinde çözün ve orta değişime hazırlanırken buzun üzerinde bırakın.
- 5 mL şartlandırılmış orta stok elde edin (4 °C'de saklayın) ve adım 1.14'te kullanıma hazır olana kadar 37 °C'lik bir su banyosunda tutun. Şartlandırılmış bir ortam veya mevcut insan fetal nöral kök hücre kültürü yoksa adım 1.2'den sonraki nota bakın.
- Adım 1.3'teki 50 mL'lik vidalı kapak tüpünü alın ve biyogüvenlik kabinine (BSC) yerleştirin. 10 mL DFHGPS'yi yeni bir 15 mL vidalı kapaklı tüpe aktarın ve ardından kalan 10 mL DFHGPS ortamını içeren 50 mL'lik tüpü 37 ° C'lik su banyosuna geri yerleştirin.
- Sıvı nitrojen içinde saklanan bir kriyo-şişe hNSC elde edin. Mevcut insan fetal nöral kök hücre kültürü yoksa adım 1.2'den sonraki nota bakın.
not: İnsan nöral kök hücreleri başlangıçta atılan insan fetal beyinlerinden türetilmiştir12 ve genetik modifikasyonlar olmadan kültürde tutulmuştur10. 5 × 106 hücre çözülmeli ve bir T75 şişesi üzerine kaplanmalıdır. Her kriyo-flakon 5 × 106 hücre içermelidir; Bu nedenle, şişe başına bir şişeye ihtiyaç vardır.
- Bir hücre şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda, şişeyi her 10 saniyede bir yaklaşık 1 dakika boyunca veya buz eriyene ve şişenin içeriği tamamen sıvı olana kadar çözdürün. Olası kontaminasyonu önlemek için tüm şişeyi suya batırmayın.
- BSC'de, çözülmüş hücre çözeltisini aspire etmek için bir P1000 mikro pipet kullanın ve 10 mL DFHGPS içeren 1.7. adımdan itibaren 15 mL'lik tüpe damla damla ekleyin. Çözülmüş hücre çözeltisini damla damla eklemek için, bir kerede yalnızca bir veya iki damla serbest kalacak şekilde pistona yavaşça bastırın. Bu arada, hızlı bir karışım sağlamak için 15 mL'lik tüpü döndürün.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini tuttuğunuzdan emin olun.
- Adım 1.11 sırasında, adım 1.7'den kalan 10 mL'yi içeren 50 mL'lik tüpü alın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 10 mL DFHGPS'de yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da tekrar santrifüjleyin.
- Son dönüş sırasında, BSC'deki adım 1.4'ten (Tablo 1) 10 mL DFHGPS ortamına büyüme faktörleri eklemek için Tablo 1'i takip ederek yeni büyüme ortamını hazırlayın. Büyüme faktörleri içeren yeni besiyerini kullanıma hazır olana kadar BSC'de bırakın.
- T75 şişesini adım 1.2'den alın ve şişeyi aspirasyon ile kaplayan şartlandırılmış ortamı atın. Ardından, adım 1.6'daki 5 mL şartlandırılmış ortamı ekleyin. serolojik bir pipet kullanarak şişeye. Şişenin altını çizmemeye dikkat edin.
- Hücre tüpünü santrifüjden alın ve süpernatanı aspire ederek atın, hücre peletini sağlam bırakın.
- 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini adım 1.13'ten itibaren 10 mL yeni ortamda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu adım 1.14'ten itibaren kaplanmış T75 şişesine ekleyin. Hücre peletini içeren tüpü durulamak için kalan 5 mL'yi kullanın ve ardından bu 5 mL'yi de şişeye ekleyin.
- Hücrelerin şişeye eşit olarak dağıldığından emin olmak için T75 şişesini 3 kez ileri geri sallayın. Hava akışına izin vermek için şişenin kapağının gevşek olduğundan emin olun. Işık mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin, notlar alın ve mümkünse görüntü alın.
not: Hücreler yarı saydam ve küresel görünmelidir. Koyu, opak görünen veya asimetrik kenarlıklara sahip hücreler olup olmadığına dikkat edin, çünkü bu hücre ölümünü gösterebilir. Ayrıca, ortamın renginin sarı olması gibi herhangi bir mantar veya bakteri kontaminasyonuna dikkat edin.
- Hücre şişesini% 8,5 CO2,
içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin
not: Bu serumsuz kültür ortamının pH'ını 7.1-7.4 aralığında tutmak için% 5.0 CO2 yerine% 8.5 kullanın.
2. hNSC Orta Değişim
NOT: Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
- BSC'yi açın ve% 70 etanol ile iyice temizleyin. Hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
not: Hücrelerin görünümü ve küre boyutları hakkında notlar alın. İyileşmeden veya geçişten üç gün sonra, hücreler bir araya toplanacak ve yapışık olmayan nöroküreler oluşturmaya başlayacaktır.
Dikkat: Hücreler şişenin dibine yapışırsa, hücre yapışması erken farklılaşmayı artıracağından ve hücreler kök durumu koruyamayacağından kültürün atılması gerekecektir. Şişede çok fazla hücre varsa, hücreler büyük küreler (çapı 2 mm'den büyük) oluşturabilir, bu durumda kürenin merkezindeki hücreler, ortamdaki büyüme faktörlerine erişim eksikliği nedeniyle farklılaşmaya başlayacaktır. Çapı 1 mm'den büyük küreler gözlenirse, hücreler geçilebilir.
- 1.4 ve 1.5 adımlarını izleyin ve 10 mL taze ortam hazırlayın (bkz. adım 1.13).
- Şişeyi yana doğru eğin ve kürelerin şişenin dibine batmasına izin verin.
- Herhangi bir nöroküre aspire etmemeye dikkat ederek, 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak havuzlanmış ortamın üstünden 5 mL şartlandırılmış ortamı çıkarın. 5 mL şartlandırılmış ortamı 15 mL'lik temiz bir tüpe yerleştirin.
- Şişeden 5 mL daha şartlandırılmış ortamı çıkarın, yine kürelerden dikkatlice kaçının ve 5 mL'yi aynı 15 mL'lik tüpe yerleştirin.
- Şişede kalan 5 mL şartlandırılmış ortam ve hücrelere adım 2.2'den 10 mL yeni ortam ekleyin. Şişeyi düz bir şekilde yere koyun ve hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
- Şartlandırılmış ortamın toplanması sırasında hücrelerin aspire edildiği görülüyorsa, şartlandırılmış ortamı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Şartlandırılmış ortamın 1 mL'sinde altta biriken hücreleri yeniden süspanse edin ve ardından bunları kültür şişesine ekleyin.
- 2.5/2.6 adımlarından 10 mL kullanılmayan şartlandırılmış ortamı 4 ° C'de 15 mL vidalı kapaklı bir tüpte saklayın.
- 1.17/1.18 adımlarını tekrarlayın.
3. hNSC Geçişi
- NSC'leri yeni bir şişeye genişletiyorsanız, tüm yeni şişelerin adım 1.2'deki gibi kaplandığından emin olun.
- BSC'yi adım 2.1'deki gibi temizleyin ve adım 1.4 ve 1.5'i uygulayın.
- Ortamı adım 1.13'teki gibi hazırlayın. Her T75 şişesi 10 mL ortam gerektirir. Birden fazla T75 şişesi için, 10 mL ortamı şişe sayısıyla çarpın.
- 1 veya 3 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (dPBS) ve glikozunu hazırlayın ve Tablo 2'deki hacimlere göre 10 dakika (tripsin çözeltisi için) ısıtmak için 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun. Şu anda tripsin veya DNaz eklemeyin. DNaz, mekanik veya kimyasal hücre ayrışması nedeniyle ölü hücrelerden salınan herhangi bir DNA'yı parçalamak için gerekli olabilir.
NOT: 9-10 günlük büyümeden sonra geçen bir T75 şişesi için, 5 × 10 6 orijinal olarak şişeyetohumlanmışsa, yaklaşık 30 × 106 hücre olacaktır. Tipik olarak, 10 × 106 hücre için 1 mL dPBS çözeltisi kullanılır. Bu nedenle, 9-10 gün sonra geçen bir T75 şişesi için 3 mL dPBS çözeltisi gereklidir.
- Kaputun içine temiz, küçük bir kantar botu ve hemositometre yerleştirin. %70 etanol ile temizleyin ve davlumbazda yaklaşık 5 dakika
kurumaya bırakın
not: Kantar botu adım 3.17.1'de kullanılacaktır.
- İnkübatörden geçecek hücrelerin şişesini alın ve BSC'ye getirin. Şişeyi nazikçe eğin ve hücrelerin havuzlanmış ortamın dibine batmasına izin verin. Şişede yaklaşık 15 mL ortam vardır.
- 5 mL'lik porsiyonlarda yaklaşık 10 mL ortamı çıkarın (ör. 5 mL + 5 mL). Bu 10 mL ortamı "şartlandırılmış ortam" için "CM" etiketli 15 mL'lik temiz bir tüpe yerleştirin. Şişede kalan 5 mL ortama yerleşen hücrelerden hiçbirini aspire etmemeye dikkat edin; bu hücreler ve 5 mL ortam adım 3.8'e tabi tutulacaktır.
- "CM" tüpünden (adım 3.7'den itibaren) 3 mL şartlandırılmış ortam alın ve "tripsin inhibitör çözeltisi" etiketli 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bu, adım 3.12'de kullanılacaktır. 3 mL'nin çıkarılmasından sonra, "CM" tüpünde 7 mL şartlandırılmış ortam kalır. "CM" tüpünü adım 3.9'a kadar bir kenara koyun.
- T5 şişesinde kalan 75 mL ortamı ve hücreleri çıkarın ve "Hücreler" etiketli 15 mL'lik temiz bir tüpe yerleştirin.
- 7 mL şartlandırılmış ortam içeren "CM" tüpünü alın (adım 3.7.1'den itibaren) ve T75 şişesinin tabanını 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 3.5 mL koşullu ortam kısımları ile iki kez durulayın. Her durulamadan sonra, 3,5 mL'lik kısımları "Hücreler" tüpüne yerleştirin. Bu adımın amacı, tüm nörosferleri (hücreleri) T75 şişesinden çıkarmaktır.
- "Hücreler" tüpünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Hücreler dönerken 37 °C su banyosundan dPBS/glukoz çözeltisi elde edin ve Tablo 2'ye göre uygun miktarda tripsin ve DNaz ekleyin.
- "Hücreler" tüpünün dönmesi durduktan sonra, şartlandırılmış tüm orta süpernatanı çıkarın ve "CM" tüpüne aktarın.
- Adım 3.7.1'den "tripsin inhibitör çözeltisi" etiketli tüpü alın ve Tablo 3'te belirtilen tripsin inhibitörünün hacmini ekleyin. Tripsin çözeltisi için kullanılanla aynı hacimde tripsin inhibitörü çözeltisi kullanın.
- Tripsin inhibitör solüsyonunu ihtiyaç duyulana kadar 37 ° C su banyosuna yerleştirin.
- 15 mL'lik tüpteki hücre peletine tripsin çözeltisi ekleyin ve 5 mL'lik bir pipet ile yaklaşık 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpün kapağını kapatın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika inkübe edin. 5 dakika sonra hücreleri alın ve 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 37 °C su banyosunda 10-15 dakika daha inkübe edin.
- Son 5 dakikada, tripsin inhibitör çözeltisini BSC'ye taşıyın.
- Adım 2.14 tamamlandıktan sonra hücreleri alın ve küreler tamamen ayrılana kadar (20-30 kez) hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hemen tripsin inhibitörü çözeltisini ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ayrışmış hücreler ve tripsin inhibitöründen oluşan bu çözelti "hücre süspansiyonu" olarak adlandırılacaktır.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücre süspansiyonundaki hücre sayısını sayın.
- 15 μL Tripan Mavisi ön karışımını (5 μL %0,4 Tripan Mavisi ve 10 μL dPBS içerir) küçük bir tartım teknesine pipetleyin ve ardından 5 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırmak için 3-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, 10 μL Tripan Blue / hücre süspansiyonunu bir cam lamel ile kaplı bir hemositometrenin her iki tarafına pipetleyin.
- Hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve dört köşe ızgarasının her birindeki toplam hücre sayısını sayın. Bu sayıları bir araya getirin.
- Diğer taraf için saymayı tekrarlayın ve iki tarafın ortalamasını alın.
- mL başına toplam hücre sayısını vermek için bu sayıyı 10,000 ile çarpın. Hücre süspansiyonundaki toplam hücre sayısını hesaplamak için bu sayıyı toplam mililitre sayısıyla çarpın. T5 şişesi başına 75 milyon hücreyi tohumlamak için ne kadar hücre süspansiyonu hacmine ihtiyaç duyulacağını hesaplayın.
not: Tipik olarak, 9-10 gün sonra, bir T75 25-30 × 106 hücreye sahip olacaktır. Bu nedenle, tüm hücreler yeni şişelere geçirilirse, toplam 5-6 şişeye ihtiyaç vardır.
- Şişe başına 5 × 106 hücre elde etmek için her bir T75 şişesine adım 3.19'da hesaplanan hücre süspansiyon hacmini ekleyin. Hacim 5 mL'den azsa, toplam 5 mL'ye kadar ek koşul ortamı ekleyin. Daha sonra şişeye büyüme faktörleri içeren 10 mL yeni DFHGFPS ortamı ekleyin (Tablo 1).
- 1.17 ve 1.18 adımlarını yineleyin ve şişenin hücre türü, tarihler, şişedeki hücre sayısı ve geçiş numarası ile etiketlendiğinden emin olun (bu, hücrenin geçişinin sayısıdır). Ardından, Adım 4'e geçin.
- Gerekirse, gece boyunca şişe başına 30 × 106 hücreye kadar yoğunlukta bir T75 şişesine fazladan hücreler ekin ve ertesi gün Adım 4'e göre dondurun.
4. hNSC Dondurma ve Depolama
- Geçtikten sonraki gün, şişeyi dondurmak için hücreleri içeren inkübatörden alın (3.19 ve 3.22 adımlarından). Şişeyi eğin ve şişedeki tüm ortamı ve hücreleri çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Ardından, tüpü 216 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjleme işlemi sırasında dondurma ortamını hazırlayın (Tablo 4). Her 5 × 106 hücre için 1 mL dondurma ortamı hazırlayın. Hücre sayısı, her bir şişeye kaç hücre konulacağı belirlenirken adım 3.19'da belirlendi. Bu sayı bir gecede değişmiş olmayacak.
- Hücre adı, geçiş numarası, hücre numarası, baş harfleri ve tarih etiketleriyle kriyo-koruma şişeleri hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspirasyon ile çıkarın ve 5 × 106 hücre / mL olacak şekilde dondurucu ortamda hücre peletini yeniden süspanse edin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak, flakon başına 1 mL alikotlayın ve sıkıca kapatın (flakon başına 5 × 106 hücre).
- Şişeleri 250 mL izopropanol içeren bir kriyo koruma kabına yerleştirin (maksimum kullanım, izopropanol değişimi başına 5 defadır). Gece boyunca -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın ve ardından sıvı nitrojen tankı depolama sistemine aktarın.
5. Doğrulama için yapışkan hNSC'nin kaplanması
- Geçişten bir gün önce (adım 3.1-3.22), BSC'yi adım 2.2'deki gibi temizleyin ve 24 oyuklu bir plaka ve steril cam 12 mm lameller elde edin.
- Forseps kullanarak, plakanın her bir oyuğunun altına tek bir lamel yerleştirin.
- Lamel içeren kuyucukları steril suda %0.01 poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. 24 oyuklu bir plaka için, oyuk başına 250 μL PDL kullanın.
- PDL'yi kuyucuklardan çıkarın ve ardından 1 μg/cm2 laminin/dPBS (oyuk başına 250 μL) ile kaplayın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün gerekmezse, parafilmi plakanın kenarlarına sararak plakayı parafilm ile kapatın ve 4 °C.
'de saklayın
not: Laminin ile kaplanmış plakalar, lameller kurumadığı sürece parafilm ile kapatılmışsa 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Hücreleri adım 3.1-3.22'de açıklandığı gibi geçirin ve ardından kaplanmış lameller ile 24 oyuklu plakaya tohumlanacak hücre sayısını belirleyin.
- Fazla laminin çözeltisini aspirasyon yoluyla kuyulardan çıkarın ve bir kez 0.5 mL dPBS ile durulayın. Daha sonra, hücreleri kuyucuk başına 0.6-1 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta kuyucuklara tohumlayın. Kalan hücreleri 3.16-3.21 adımlarına göre kullanın.
- 24 oyuklu plaka kültürü sırasında çeşitli zamanlarda, çeşitli kök hücre belirteçleri için hücreleri sabitleyin ve boyayın.