$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. iPSC Agregalarının Oluşturulması
- iPSC kolonilerinden tek hücreli tek tabakalı kültürlerin üretilmesi
- Bir bazal membran özü (BME) kaplı 6 oyuklu plaka hazırlayın. BME'yi buz üzerinde 4 ° C'de 2-3 saat çözdürün, soğuk Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 seyreltme) ile seyreltin, plakayı 1 mL / kuyu seyreltilmiş BME çözeltisi ile kaplayın ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Ortamı aspire edin ve kolonileri oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca PBS'de 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile inkübe etmeden önce iki kez fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 0.5 mM EDTA'lı 6 oyuklu bir plakanın en az iki oyuğunun bozulmamış iPSC kolonilerini yıkayın. EDTA solüsyonunu aspire edin ve kolonileri 5 mL DMEM-F12 ortamı ile tabağın dibinden yıkayarak nazikçe ayırın. Bunları 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve santrifüjleme ile peletleyin (RT'de 1.200 x g'da 4 dakika).
NOT: Ticari olarak temin edilebilen fibroblastlardan yeniden programlanan iPSC'ler başarıyla kullanılmıştır.
- Süpernatanı aspire edin ve iPSC kolonilerini 500 μL hücre ayrışma reaktifi ile 37 ° C'de 6 dakika boyunca inkübe edin.
- Kalan hücre kümelerini tek hücrelere ayırmak için hücre süspansiyonunu 1 mL'lik bir pipetle birkaç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücre ayrışma reaktifini seyreltmek için hücre süspansiyonuna 4 mL DMEM-F12 ekleyin.
- Hücreleri RT'de 4 dakika boyunca 1.200 x g'da döndürün.
- Hücreleri, 5 μM Y-27632 ile takviye edilmiş 2 mL iPSC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri BME kaplı 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna tohumlayın.
not: Tek hücreli tek katmanlı iPSC kültürleri için Malzeme Tablosunda belirtilen iPSC ortamını kullanın.
- Ertesi gün, ortamı Y-27632 içermeyen yeni iPSC ortamıyla değiştirin. Bu noktadan sonra, iPSC'ler %100 birleşene kadar ortamı her gün değiştirerek hücreleri kültürlemeye devam edin. Hücre hattına ve başlangıç kuyularının birleştiği yere bağlı olarak, bu 2-4 gün sürecektir.
- Bir kez birleştikten sonra, iPSC'leri geçin. Besiyerini aspire edin ve hücrelere 500 μL hücre ayrışma reaktifi uygulayın.
- Hücreleri 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin. Hücreleri ayırmak için plakayı hafifçe sallayın.
- Hücreleri 2 mL DMEM-F12 kullanarak kuyudan yıkayın ve 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Toplam 5 mL hacim için DMEM-F12 ekleyin.
- Hücreleri RT'de 4 dakika boyunca 1.200 x g'da döndürün ve süpernatanı aspire edin.
- Hücreleri, BME kaplı 6 oyuklu bir plaka (2 mL / orta oyuğu) üzerinde 1: 2 ila 1: 4 oranında 5 μM Y-27632 ile takviye edilmiş iPSC ortamında tohumlayın.
- Hücreleri 2-5 gün boyunca kültürlemeye devam edin ve her gün Y-27632 içermeyen iPSC ortamını değiştirin. Bir kez birleştiğinde, iPSC'leri geçin (adım 1.1.4-1.1.8).
not: Hücrelerin kültür koşullarına uyum sağlamasına izin vermek için iPSC agregalarının oluşturulması için kullanmadan önce, iPSC'leri Malzeme Tablosunda belirtilen iPSC ortamında tek tabaka olarak en az 2 geçiş için kültürleyin.
- iPSC agregalarının üretilmesi için %70-90 oranında birleştiğinde tek katmanlı iPSC kültürlerini kullanın.
NOT: iPSC, tek hücrelerin ayrışma ve agregasyon prosedürü sırasında hücre ölümüne yol açan strese daha az eğilimli olması nedeniyle kültür koşullarına uyarlanmıştır. Tek katmanlı iPSC kültürlerinin, farklılaşma kanıtı olmaksızın tipik pluripotent morfoloji göstermesi gerekir. Kültürleri mikoplazma kontaminasyonu için düzenli olarak test edin. Yalnızca mikoplazma içermeyen iPSC kültürleriyle çalışın.
- Kültür ortamını 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan aspire edin ve hücrelere 500 μL hücre ayrışma reaktifi uygulayın.
- Hücreleri 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin. Hücreleri ayırmak için plakayı hafifçe sallayın.
- 2 mL DMEM-F12 kullanarak hücreleri kuyudan yıkayın ve bunları 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Toplam 10 mL hacim için DMEM-F12 ekleyin.
- Hücre sayımı için, hücre süspansiyonundan 25 μL alın ve ölü hücreleri işaretlemek için 25 μL tripan mavisi ile karıştırın. Bir sayma odası kullanarak canlı hücreleri sayın.
- 15 mL'lik bir tüpte hücre süspansiyonundan yeterli sayıda hücre (iPSC agregası başına 4.500 hücre) toplayın.
- Hücreleri RT'de 4 dakika boyunca 1.200 x g'da döndürün ve süpernatanı aspire edin.
- 150 μL.
başına 4.500 canlı hücre elde etmek için hücreleri 50 μM Y-27632 ile takviye edilmiş uygun bir hacimde iPSC ortamında yeniden süspanse edin
not: Yüksek konsantrasyonda Y-27632 (50 μM) kullanılması, iPSC'lerin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir.
- Düşük bağlantılı 96 oyuklu U-tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 150 μL plaka koyun ve 37 °C ve %5 CO2.
'de inkübatöre yerleştirin
not: iPSC agregaları oluştururken, 20. günde kalite kontrol için en az 6 organoidin gerekli olduğunu göz önünde bulundurun (bkz. Bölüm 5).
2. Anterior Nöroektodermin İndüksiyonu
- iPSC agregalarının morfoloji değişikliklerini her gün doku kültürü mikroskobu altında 4X veya 10X güç lensi kullanarak yakından izleyin. 1. günde, net kenarlıklı hücre kümelerini gözlemleyin. iPSC agregalarını inkübatörde 37 °C ve %5 CO2.
'de kültürlemeye devam edin
not: Belirli sayıda ölü hücre/kuyu normaldir ve organoid oluşumunu etkilemez.
- iPSC agregalarını 2. günden başlayarak ve alttaki hücre agregalarını bozmadan, ortamın yaklaşık 2/3'ünü nazikçe aspire ederek gün aşırı devam ederek besleyin. Y-27632.
içermeyen ek bir 100 μL iPSC ortamı ekleyin
not: 4-6 gün içinde hücre agregaları 350-450 μm çapında olacak ve pürüzsüz kenarlar sergileyecektir.
- Bu aşamada, hücre agregalarını 100 μL'lik bir kesilmiş pipet ucu ile N2 takviyesi (1:200), B27 takviyesi (1:100), glikoz (0.2 mg/mL), siklik adenozin monofosfat (cAMP; 0.15 μg/mL), %0.5 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) ile DMEM-F12 içeren kortikal indüksiyon ortamında düşük bağlantılı 6 cm'lik bir tabağa (maksimum 20 agrega/tabak) havuzlayın, % 1 L-alanil-L-glutamin, heparin (10 μg / mL) ve LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) bileşikleri ve Wnt yanıtı-1 (IWR-1) inhibitörü (10 μg / mL). Hücre agregalarını, 6 cm'lik tabağa aktardıktan 3 gün sonra kortikal indüksiyon ortamını değiştirerek besleyin.
- Kortikal indüksiyon sırasında doku kültürü mikroskobu altında 4X güç lensi kullanarak morfolojik değişiklikleri yakından izleyin.
not: Kortikal indüksiyon ortamında 4-5 gün sonra, hücre agregatlarının kenarları yüzeyde parlamaya başlamalıdır, bu da nöroektodermal farklılaşmayı gösterir. Bu aşamada, psödostratifiye bir epitelin radyal organizasyonu ortaya çıkar. Hücre agregalarını bir BME matrisine gömmek için Bölüm 3'e geçin.
3. Nöroektodermal Agregaların Bir Matris İskelesine Gömülmesi
- BME'yi buz üzerinde 4 ° C'de 2-3 saat çözdürün.
- Gömme prosedürü için plastik bir parafin film tabakası hazırlayın. Plastik parafin filmi steril makas kullanarak 4 cm x 4 cm büyüklüğünde parçalar halinde kesin, plastik parafin filmden bir parçayı 100 μL'lik boş bir 100 μL uç tepsisine koyun ve eldivenli bir parmakla bastırın, böylece plastik parafin film tabakasında küçük çukurlar oluşur (1 çukur/hücre agregası gereklidir). Plastik parafin filmi %70 etanol ile temizleyin ve kapalı steril tezgahın altında 30 dakika boyunca UV ışığı (güç: 15 watt, dalga boyu: 435 nm) ile ışınlayın.
- Her hücre agregasını, çapı 1.5-2 mm olan 100 μL'lik bir kesme ucu kullanarak plastik parafin film tabakasının bir çukuruna aktarın. İki hücre agregasının kaynaşması durumunda, onları ayırmayın, ancak tek bir çukura aktarın.
- Kesilmemiş 100 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre agregalarını çevreleyen ortamı nazikçe aspire edin.
not: Agregalara zarar vereceği için hücre agregalarını uca emmemeye dikkat edin.
- Her hücre agregasına 40 μL seyreltilmemiş BME ekleyin.
- Kesilmemiş 100 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her hücre agregasını BME damlasının ortasına yerleştirin.
not: Pipet ucu ile gelişmekte olan nöroepitele zarar vermemeye çok dikkat edin.
- Plastik parafin film tabakasını steril forseps kullanarak 10 cm'lik bir Petri kabına (veya başka bir yeterli hücre kültürü kabına) dikkatlice aktarın ve BME'nin katılaşmasını sağlamak için kabı 15-20 dakika inkübatöre yerleştirin.
- Bu arada, 5 mL kortikal indüksiyon ortamı içeren düşük bağlantılı 6 cm'lik bir tabak hazırlayın.
- BME'nin polimerizasyonundan sonra, hücre agregalarını içeren damlacıkları plastik parafin film tabakasından çıkarın. Steril forseps kullanarak, plastik parafin filmi ters çevirin ve hücre agregalarını, damlacıklar plastik parafin film tabakasından düşene kadar hafifçe eğimli (yaklaşık 30 °) düşük bağlantılı 6 cm'lik tabağa hafifçe sıkın. En fazla 16 hücre agregasını 6 cm'lik bir tabağa aktarın.
- Hücre agregalarını 37 °C'de inkübe etmeye devam edin.
4. Nöroektodermal Agregatlardan Ön Beyin Tipi Organoidlerin Üretilmesi
- Bir BME matrisine gömdükten bir gün sonra, organoid kültür kaplarını, bir hücre kültürü inkübatörüne monte edilmiş, 5 ° ve 14 rpm eğme açısına sahip sallanan bir hücre kültürü çalkalayıcısına yerleştirin.
- Organoidleri her gün izleyin. Homojen nöroepitelyal döngü benzeri yapılar, BME matrisine gömüldükten sonra yavaş yavaş gelişir.
- Nöroepitelyal döngü yapıları görünür olduğunda, ortamı N2 takviyesi (1:200), B27 takviyesi (1:100), glikoz (0.2 mg/mL), cAMP (0.15 μg/mL), %0.5 NEAA, %1 L-alanil-L-glutamin, insülin (2.5 μg/mL) ile DMEM-F12 içeren organoid farklılaşma ortamına değiştirin
- İstenen farklılaşma zaman noktasına ulaşılana kadar organoid farklılaşma ortamını her 3-4 günde bir değiştirin. Ardından, organoidleri düzeltin (bkz. Bölüm 5).
not: Bazen doku, ilmek yapıları olmayan optik olarak yarı saydam doku tomurcukları sergileyebilir. Bu ideal olmasa da, bu kortikal yapıların gelişimini etkilemez. Organoidler, organoid farklılaşma ortamında 40 güne kadar kültürlenebilir. Uzun kültür dönemleri (40-100 gün) için organoid farklılaşma ortamı, doku karmaşıklığını artırmak için 1:50 BME ve nöronal sağkalım ve olgunlaşmaya izin vermek için BDNF ve GDNF ile desteklenebilir.