$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. iPSC kültürü ve BEC farklılaşması için gerekli malzemelerin hazırlanması.
- IMR90-4 iPSC kültürü için doku kültürü (TC) plastiğinin matris kaplaması
- Aliquot bazal membran matris jeli (ör., Matrigel) 2.5 mg alikotlara indirin ve -20 °C.
'de saklayın
not: Matris jeli ve alikotu buz üzerinde tutarken hızlı çalışın, çünkü 4 °C'nin üzerinde bir jel oluşturur ve katılaştıktan sonra alıntılanamaz.
- TC plastiği kaplamak için, 50 mL'lik konik bir tüpte 30 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) / F12 ortamına hızlı bir şekilde bir matris jeli alikotu ekleyin. Donmuş matris jeli üzerine 1 mL ortam ekleyin, çözülene kadar yukarı ve aşağı pipetleyin ve kalan ortamla birlikte hemen 50 mL konik tüpe aktarın.
- 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına bu matris jel kaplama çözeltisinden 1 mL ve T75 şişesi başına 12 mL kullanın.
not: Matris jel kaplı TC plastik, kullanılmadan önce iki haftaya kadar hazırlanabilir. Bununla birlikte, matris jel çözeltisinin kurumasını önlemek çok önemlidir, bu da kuyucukların üzerine ara sıra daha fazla DMEM / F12 eklenmesini gerektirebilir.
- Bir biyogüvenlik kabininin steril ortamında 450 mL kök hücre bakım bazal ortamına 50 mL 50x takviyesi ekleyerek kök hücre bakım ortamını hazırlayın.
- 500 mL koşulsuz ortam (UM) hazırlamak için, 392.5 mL DMEM / F12'yi 100 mL nakavt serum replasmanı (KOSR), 5 mL esansiyel olmayan amino asit, 1 mM'lik nihai konsantrasyonda L-glutamin ve 3.5 μL β-merkaptoetanol. Filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- 200 mL endotel hücre (EC) ortamı artı retinoik asit (RA) artı bFGF hazırlamak için, 198 mL insan endotel serumu serbest ortamı (hESFM), 2 mL filtreyle sterilize edilmiş trombositten fakir türetilmiş serum (PDS) ve 20 ng / mL bFGF'yi birleştirin. Filtre, sterilize edin ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. Hücrelere eklemeden hemen önce, EC ortamına 10 μM RA ekleyin.
not: PDS kullanımdan kaldırıldığından ve bu nedenle sınırlı olabileceğinden, bu protokol PDS yerine B27 kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.
- RA veya bFGF içermeyen 200 mL EC ortamı hazırlamak için 198 mL hESFM ve 2 mL filtre ile sterilize edilmiş PDS'yi birleştirin ve filtre sterilize edin. 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
2. Beyin endotel hücrelerinin insan iPSC'lerinden farklılaşması
- Farklılaşma için iPSC'lerin kaplanması (farklılaşma protokolünün -3. günü)
- IMR90-4 bakım kültürüne göre, farklılaşma için plakalamak, kültür ortamını aspire etmek, oyuk başına 1 mL enzimatik hücre ayrışma reaktifi eklemek ve 37 ° C'de 7 dakika inkübe etmek için iyi kullanılır.
- 1 mL ayrışmış hücre süspansiyonunu, 1 mL hücre başına en az 2 mL taze kök hücre bakım ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak enzimatik hücre ayrışma reaktifini inaktive edin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
- Kullanılan IMR90-4 hücrelerinin kuyusu başına 1 mL kök hücre bakım ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.
not: Sayarken canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 1:1'i %0.4 tripan mavisi ile seyreltmek yardımcı olabilir. iPSC'lerin yoğunluğuna bağlı olarak, 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğu genellikle 1\u20122 x 106 hücre verir.
- Bir T75 şişesinde farklılaşma için, 12 mL kök hücre bakım ortamına ve 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda ROCK inhibitörüne (Y27632 dihidroklorür) 7.5 x 105 hücre ekleyin. Bir T75 şişesinden matris jel kaplama solüsyonunu aspire edin ve hücre süspansiyonunu şişeye aktarın. Şişeyi ileri geri ve soldan sağa sallayarak hücreleri eşit olarak dağıtın ve 37 ° C ve% 5 CO2.
'de inkübe edin
not: Ayrışmış tek kök hücrelerin sağkalımını artırmak için bu adımda ROCK inhibitörü eklemek çok önemlidir. Hücreler, şişe boyunca ve ROCK inhibitörü tedavisine bağlı olarak yayılımlı, mezenkimal benzeri bir morfoloji sergileyen tekiller halinde eşit olarak dağıtılmalıdır.
- -2. gün ve -1. günlerde, ortamı taze kök hücre bakım ortamına değiştirin; T75 başına 12 mL.
- 0. günde, ortamı UM olarak değiştirerek farklılaşmaya başlayın; T75 başına 12 mL.
- UM'yi günlük olarak değiştirin (1. gün – 5. gün).
not: Hücreler tipik olarak UM'de 2 ila 3 gün sonra birleşir, bu da çıplak gözle veya ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu ile gözlemlenebilir. Farklılaşma ilerledikçe, nestin+ "nöral yollar" aradaki PECAM-1+ hücreleri ile görünür hale gelir.
- 20 ng/mL bFGF ve 10 μM retinoik asit (RA) (6. gün) ile EC ortamına geçerek ve iki gün inkübe ederek endotel hücre popülasyonunu seçici olarak genişletin. bFGF'li EC besiyeri iki hafta öncesine kadar hazırlanabilir. RA, kullanım gününde donmuş stoktan eklenir (örneğin, 1 mL EC + bFGF başına 1 μL 10 mM RA stoğu).
not: Başarılı farklılaşma, 6. ve 8. günlerde RA takviyesi olmadan da elde edilebilir. Bununla birlikte, RA'nın ihmal edilmesi, azaltılmış TEER'li BEC'lere yol açacaktır.
- BEC'lerin saflaştırılması ve deneylerin ardından hücre kültürü plakalarını ve membran eklerini (ör., Transwell) kollajen IV ve fibronektin (7. gün) ile kaplayın.
- Membran eklerinin kaplanması için 4 kısım kollajen IV (0.5 mg/mL asetik asit içinde 1 mg/mL), 1 kısım fibronektin (1 mg/mL) ve 5 kısım steril doku dereceli suyu birleştirin. ECM çözeltisi, hücre kültürü plakalarını kaplamak için 1:5 oranında seyreltilebilir (yani, 4 kısım kollajen IV, 1 kısım fibronektin, 45 kısım su). Gece boyunca 37 ° C'de kaplama çözeltisi ile inkübe edin.
NOT: Plakalar ve membran ekleri, saflaştırma adımının aynı gününde alt kültürlemeden önce en az 4 saat boyunca kaplanabilir.
- Farklılaşmış hücreleri kollajen IV ve fibronektin kaplı plakalar veya membran ekleri üzerinde alt kültüre alarak BEC'leri saflaştırın (8. gün).
- EC ortamını aspire edin ve enzimatik hücre ayrışma reaktifi ekleyin (T75 başına 12 mL). Hücrelerin %90'ı şişeden ayrılana kadar 37 °C'de inkübe edin.
not: Hücre ayrışması 1 saate kadar sürebilir.
- İnkübasyon süresi boyunca, kollajen IV / fibronektin kaplama solüsyonunu önceden hazırlanmış plakalardan / eklerden çıkarın ve steril bir başlıkta kurumaya bırakın. Eklerin kuruması yaklaşık 20 dakika sürer.
- Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Tek hücreli süspansiyon, güvenilir hücre sayımı ve katı tek tabakalar elde etmek için önemlidir.
- 50 mL'lik konik bir tüpte en az eşit hacimde taze hESFM ile seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 1.500 x g'da peletleyin.
- Membran eklerinde tohumlama için 2 x 10 6 hücre / mL'lik bir süspansiyon elde etmek için hücreleri uygun hacimde taze hazırlanmışEC + bFGF + RA içinde yeniden süspanse edin. 12 oyuklu bir ekin üstüne 500 μL (1 x10, 6 hücre) ve altına 1,5 mL EC + bFGF + RA ortamı ekleyin. 24 ve 48 oyuklu plakalara tohumlama için, hücre süspansiyonunu 1: 2 oranında seyreltin ve oyuk başına sırasıyla 500 μL (5 x 105 hücre) ve 250 μL (2.5 x 105 hücre) ekleyin. Hücreleri kuyu boyunca eşit olarak dağıtın / yerleştirin ve 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.
- Plakalar/transwelller üzerindeki medyayı bFGF veya RA olmadan EC olarak değiştirin (9. gün).