Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>1. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
5-6 farenin periaortik ark yağ dokusunu (PAAT) 1 mL taze hazırlanmış sindirim ortamı içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve dokuyu oda sıcaklığında (RT) bir Eppendorf tüpünde cerrahi makas kullanarak kıyın.
- Karışımı, 9 mL sindirim ortamı içeren 50 mL'lik tüplere aktarın. 1 mL'lik bir pipetle 10x yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuları homojenize edin.
- Tüpleri 37 ° C'de 100 rpm'de 30-45 dakika boyunca sürekli çalkalayarak inkübe edin ve aşırı sindirimi önlemek için her 5-10 dakikada bir kontrol edin. Bu, hücre canlılığını ve verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.
not: İyi doku sindirimi, tüpü hafifçe döndürdüğünde çıplak gözle görülebilen homojen, açık sarı bir yağ dokusu ile sonuçlanacaktır.
- RT'de %10 FBS ve %1 v/v PS içeren 5 mL HDMEM ekleyerek sindirimi durdurun ve pipetleyerek iyice karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. SVF kahverengimsi bir topak olarak görünecektir. Yüzen adipositleri dikkatlice aspire edin ve SVF'yi rahatsız etmeden kalan süpernatanı boşaltın. SVF peletini 10 mL kültür ortamında çözün ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti RT'de 10 dakika boyunca 15 mL'lik bir konik tüpte 5 mL eritrosit lizis tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin.
- % 1 FBS içeren 10 mL 1x PBS ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti% 1 FBS içeren 10 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 4 ° C'de 15 mL'lik bir konik tüpte 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Son bir santrifüjleme turundan sonra (4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g), peletlenmiş hücreleri 5 mL FACS tamponunda (% 10 FBS, 100 birim / mL DNA I ve% 1 v / v PS içeren PBS) buz üzerinde yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre ile sayın.
2. NCADSC'lerin FACS ile İzolasyonu
- Kullanım kılavuzunu izleyerek hücre sıralayıcıyı kurun ve optimize edin. 100 μm'lik nozulu seçin, toplama tüplerini sterilize edin, gerekli toplama cihazını takın ve yan akışları ayarlayın.
- RFP+ hücrelerini sıralamak için 561 nm sarı/yeşil lazer ve optik filtre 579/16 önerilir. Negatif kontrolü ve tek lekeli pozitif kontrolleri kullanarak kompanzasyon işlemini gerçekleştirin. Geçit şeması için Şekil 1A'ya bakın.
- Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten süzün, 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve 0.5-1 x 107 / mL yoğunlukta 2 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri açıkça etiketlenmiş 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın ve sıralayıcıya yükleyin.
- Deneysel numune tüpünü 4 °C'de çalıştırın, saptırma plakalarını açın ve %1 FBS ve %1 v/v PS.
içeren RPMI ile önceden kaplanmış 15 mL'lik konik bir tüpe ayırın
not: RFP söndürmeyi en aza indirmek için numuneleri güçlü ışıktan koruyun.
3. NCADSC'lerin Kültürü
- Sıralanan hücreleri 5.000 hücre /cm2 yoğunlukta 12 oyuklu bir kültür plakasında tam kültür ortamında kaplayın ve 37 ° C'de nemli bir atmosferde 20-24 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Kültür ortamını çıkarın, hücre kalıntılarını gidermek için hücreleri önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS ile yıkayın ve taze kültür ortamı ekleyin.
