Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Steril Poli-D-lizin (PDL) ve Laminin Çözeltilerinin Hazırlanması
- Hücre izolasyonundan en az bir gün önce, poli-D-lizin (PDL) ve laminin kaplı plakalar hazırlayın.
not: Deney hedeflerine bağlı olarak hem 6 oyuklu hem de 12 oyuklu plakalar hazırlandı. Tipik olarak, western blotları kullanılarak kantitatif analiz için 12 oyuklu plakalar kullanılırken, immünohistokimya için otoklavlanmış (steril) lamelleri tutmak için 6 oyuklu plakalar kullanıldı. Ca2+ akı görüntüleme için enterik glial hücreleri (EGC'ler) kültürlemek için 24 oyuklu plakalar kullanıldı.
- Stok çözeltilerini, HEPA ile filtrelenmiş havaya sahip bir doku kültürü başlığında ultra saf doku kültürü derecesi, DNaz içermeyen ve RNaz içermeyen su ile seyreltin.
- Cam lamellerin sterilize edilmesi
- Lameli steril forseps ile tutun ve lamelleri 15 dakika boyunca %100 etanol içeren bir behere daldırın. Etanolün doku kültürü başlığında buharlaşmasına izin verin ve ardından 6 oyuklu plakalara yerleştirin.
- Alternatif olarak, plastik bir kapta 2 mm kalınlığında kurutma kağıdına birkaç lamel ayrı ayrı yerleştirin ve ardından otoklavlayın.
2. Kaplama Plakaları
NOT: Bu adımları steril doku kültürü laminer akış başlığı altında gerçekleştirin.
- 1 mg / mL PDL stoğunu çözün ve nihai konsantrasyon 100 μg / mL olacak şekilde steril, doku kültürü dereceli su ile 1:10 oranında seyreltin. 6 oyuklu plakaları kaplamak için oyuk başına 2 mL, 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğunu kaplamak için 1 mL ve 24 oyuklu plakalardaki bir kuyucuk için 0,5 mL kullanın. Kalan seyreltilmiş PDL'yi -20 ° C'de 12 mL alikotlarda saklayın.
- PDL'nin kuyucukları en az 1 saat kaplamasına izin verdikten sonra, PDL'yi steril bir pipetle çıkarın. Plakaların bir doku kültürü laminer akış başlığı altında tamamen kurumasına izin verin.
not: PDL solüsyonu steril bir pipet ile çıkarıldıktan sonra 0,22 μm filtreden geçip 4 °C'de saklandıktan sonra 1 hafta içinde iki kez daha kullanılabilir.
- Jel oluşumunu önlemek için laminin stoğunu buz üzerinde çözdürün.
not: Seyreltilmemiş laminin, 8 °C'nin üzerinde ısıtıldığında katılaşır.
- 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için laminin stoğunu (0.5 mg / mL) steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile 1:50 oranında seyreltin. Seyreltilmiş laminini -20 ° C'de 12 mL alikotlarda saklayın.
- Kurutulmuş PDL içeren oyuklara seyreltilmiş laminin ekleyin. 6 oyuklu yüzeyi kaplamak için 1 mL ve 12 oyuklu plakaların altını kaplamak için 0,5 mL kullanın. Lameller için, yüzey kaplaması elde etmek için lamellere 400 μL seyreltilmiş laminin ekleyin.
- Kaplanmış plakaları aynı gün kullanılıyorsa, 37 °C'de 2 saat inkübe edin (hızlı kaplama). Değilse, plakaları streç filmle kapatın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın (yavaş kaplama).
not: Sızdırmazlık, kurumayı ve kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir.
- Yüzeyin çizilmesini önlemek için laminin solüsyonunu bir pipetle dikkatlice çıkarın. Kuyuları steril DPBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
- Her bir kuyucuğa tam glial büyüme ortamı ekleyin ve EGC süspansiyonunu eklemeye hazır olana kadar plakaları 37 °C'de tutun.
not: Poli-D lizin ve laminin kaplı plakalar 4 °C'de 3 gün boyunca saklanabilir. Plakaları birkaç gün önceden kaplayın ve ardından 4 °C'de saklayın; Plakaları steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS) ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra her kuyucuğa 2 mL steril DPBS ekleyin. Plakayı parafilm ile kapatın ve 4 °C'de saklayın. Lamininin kurumamasını sağlamak önemlidir.
3. İzolasyon Solüsyonlarının Hazırlanması
- EDTA/HEPES/DPBS ayrışma çözeltisini hazırlayın. 500 mL çözelti için, 10 mM HEPES ve 5 mM EDTA'dan oluşan nihai bir çözelti yapmak için steril DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) kullanın. 490 mL DPBS'ye 5 mL 1 M HEPES tamponu ve 5 mL 0.5 M EDTA stok çözeltisi ekleyin. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Tablo 1'de listelenen reaktifleri kullanarak glial hücre resüspansiyon ortamını hazırlayın.
- Tablo 2.
'da listelenen reaktifleri kullanarak glial büyüme ortamı hazırlayın
not: GDNF içeren glial büyüme ortamı 4 °C'de bir hafta süreyle saklanabilir.
4. Bağırsak Segmentinin Çıkarılması
>NOT: Farelere, izofluran damla yöntemiyle ötenaziden önce yiyecek ve suya ücretsiz erişim ve hayati bir organın çıkarılmasına izin verildi. 8 haftalıktan büyük C57BL / 6 fareler kullanıldı. Her iki cinsiyet de hazırlıkta gözle görülür farklılıklar olmadan kullanıldı.
- Fareyi aşırı dozda izofluran ile ötenazi yapın ve sırtüstü bir diseksiyon tepsisine yerleştirin. Ekstremiteleri sabitleyin ve karnı% 70 etanol ile sterilize edin. Cildi forseps ile örtün ve ardından karnı makasla açın.
- Karaciğeri kaldırın ve distal mide/piloru tanımlayın. Daha sonra proksimal bağırsağın 7 cm'sini çıkarın. Bağırsağı yırtmamaya dikkat edin.
- Meenteri keserken piloru forseps ile tutun.
- Yapışık pankreası kazımak için makasın arkasıyla künt diseksiyon kullanın.
- Bağırsak segmentini Ca2+ veya Mg2+ olmadan buz gibi soğuk DPBS'ye yerleştirin (Şekil 1A).
not: Bağırsağın veya kolonun diğer bölümleri de aynı teknik kullanılarak çıkarılabilir.
- Dışkı içeriğini buz gibi soğuk DPBS ile temizlemek için künt uçlu 20 G'lik bir iğneye bağlı 5 veya 10 mL'lik bir şırınga kullanın (Şekil 1B).
- Boyuna kası çıkarmak için bağırsağı 3 cm'lik segmentlere bölün. NOT: HEPES / EDTA / DPBS izolasyon çözeltisinin 30 mL'si başına en fazla iki fareden alınan bağırsak segmentleri kullanılır.
- Tahta çubuğu pamuk ucundan ayırmak için yaklaşık 4 cm koparın. Tahta çubuğu DPBS'ye batırın (Şekil 1C).
- Bağırsak segmentlerinden birini ıslatılmış çubuğun üzerine düzgün bir şekilde kaydırın (Şekil 2A-C).
- İğne burunlu forseps kullanılarak hala bağlı olan yapışık mezenteri çıkarın (Şekil 2D).
- Mezenterin takıldığı bağırsak boyunca iki uzunlamasına çentik yapmak için temiz bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın (Şekil 2E).
- Pamuk ucunu DPBS ile ıslatın. Uzunlamasına kas/myenterik pleksusu (LMMP) gevşetmek için ıslatılmış pamuğun ucunu kas boyunca uzunlamasına ovalayın. Ardından, LMMP'nin çıkarılması sırasında LMMP'yi bağırsak segmentinin uzunluğu boyunca dairesel kastan uzaklaştırmak için pamuk ucunu yatay olarak hareket ettirin.
- Orta ve dördüncü parmakla segmenti sabitlerken çubuğun ucunu başparmak ve işaret parmağı arasında tutun (Şekil 2F). Tamamlandığında, LMMP bağırsak segmentini kolayca soyacaktır.
- Mienterik pleksustan EGC'lerin toplanması istenmedikçe, bağırsak tüpünden sıyrılan ve pamuklu çubuğa bağlanan LMMP'yi atın.
- Tahta çubuktan çıkarmak için bağırsak segmentini uzunlamasına açmak için bir tıraş bıçağı kullanın.
- Soyulmuş bağırsak dokusunu (ağırlıklı olarak mukoza ve submukoza artı dairesel kas) DPBS'de buz üzerinde saklayın. Tüm bağırsak segmentleri hazırlanana kadar 4.4–4.11 adımlarını tekrarlayın.
5. Epitel mukozasının çıkarılması
- Bağırsakları ince makasla ~ 0,5 cm'lik daha küçük parçalar halinde kesin.
- Dokuyu 30 mL buz gibi soğuk EDTA/HEPES/DPBS solüsyonu içeren steril 50 mL'lik konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Doku içeren solüsyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca dakikada ~60 eğimle sallayın.
- EDTA/HEPES/DPBS tamponunu bir kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 5 mL'lik bir plastik pipeti önceden nemlendirin ve ardından dokuyu pipetlemek için önceden nemlendirilmiş pipeti kullanın ve epitel mukozasını çıkarmak için süspansiyonu 20 kez yukarı ve aşağı tamponlayın (tritürasyon).
- Karışımı 100 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden dökerek dokuyu EDTA inkübasyonundan toplayın. Bulanık mukoza dolu akışı atın (Şekil 3).
- Süzgeçte tutulan dokuyu, iğne burunlu forseps kullanarak 30 mL buz gibi EDTA/HEPES/DPBS içeren 50 mL'lik yeni bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Ek epitel mukozasını çıkarmak için dokuyu 4 ° C'de 10 dakika boyunca dakikada ~ 60 eğimle sallayarak EDTA / HEPES / DPBS inkübasyonunu ikinci kez tekrarlayın.
- 5 mL'lik bir pipeti tamponla önceden nemlendirin ve ardından mukoza hücrelerini çıkarmak için doku süspansiyonunu 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Epitelin daha fazlası çıkarıldıkça doku pipetin içine yapışma eğiliminde olacaktır.
- İkinci inkübasyondan sonra karışımı 100 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden dökerek dokuyu toplayın ve akışı atın. İkinci akış, birinciden belirgin şekilde daha az bulanık olmalıdır (Şekil 3).
- Çözelti neredeyse berrak olana kadar 10 dakikalık EDTA inkübasyonlarını tekrarlayın (doku miktarına ve triturasyonun etkinliğine bağlı olarak yaklaşık 3 ila 4 inkübasyon) (Şekil 3).
6. Lamina Propria ve Submukozadan Enterik Glial Hücrelerin Toplanması
- Dokuyu naylon süzgeçten 5 mL ticari olarak temin edilebilen hücre geri kazanım solüsyonu içeren 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 25-30 dakika boyunca sallayın.
- Enterik glial hücreleri lamina propriadan ayırmak için 10 kat hafifçe tritüre edin.
- 40 μm'lik bir filtreden süzün ve süzüntüyü 50 mL'lik temiz bir tüpte toplayın.
- Naylon filtredeki dokuyu 1 mL DPBS ile durulayın.
- Dokuyu atın ve ~ 5-6 mL filtratı temiz bir 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
- Süzüntüyü 2,000 ° C'de 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde 4 x g'da döndürün.
- Glial hücre içeren peleti, 500 μL'lik bir pipet ucuyla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek en az 1 mL yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Baloncukları tanıtmaktan kaçının.
not: Kuyucuk ve plaka sayısı için yeniden süspansiyon hacmini gerektiği gibi ayarlayın. Örneğin, bir 6 oyuklu plaka için 1.2 mL, iki 6 oyuklu plaka için 2.4 mL, bir 12 oyuklu plaka için 2.4 mL.
- Glial büyüme ortamı içeren 12 oyuklu PDL-laminin kaplı plakalar için 6 oyuklu veya 100 μL'lik her bir oyuğa 200 μL hücre süspansiyonu pipetleyin.
- Hücreleri plakalara ekledikten ve maksimum hücre sayısının yapışmasını sağlamak için 37 °C inkübatöre yerleştirdikten sonra bulaşıkları rahatsız etmeyin.
not: Sağlıklı bir hücre hazırlığı 6-8 saat içinde yapışır, ancak ortamı değiştirmeden önce en az 24 saat bekleyin, yapışkan olmayan hücrelerle birlikte ortamı nazikçe pipetleyerek temizleyin.
- Hücreleri kültüre yerleştirildikten 3-4 gün sonra deneyler için kullanın (Şekil 4).
Tablo 1. Glial hücre resüspansiyon ortamının bileşimi.
Serisi
| Bileşen | Eklenecek hacim | Son Konsantrasyon |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 5 mL | %10 |
| Penisilin-Streptomisin | 500 μL | 100 IU/mL Kalem |
| Streptomisin | | 100 μg/mL Strep |
| Gentamisin (50 mg/mL stok) | 20 μL | 20 μg/mL |
Tablo 2. Glial Hücre Büyüme Ortamının Bileşimi
Serisi
| Bileşen | Eklenecek hacim | Son Konsantrasyon |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 5 mL | %10 |
| Penisilin-Streptomisin (100x) | 500μL | 100 IU/mL (Kalem) |
| 100 μg/mL (Strep) | | |
| Gentamisin (50 mg/mL stok) | 20 μL | 20 μg/mL |
| GDNF (10 μg/mL stok) | 50 μL | 10 ng/mL |
