Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Domuz Beyin Kılcal Damarlarının Saflaştırılması
- 5-6 aylık evcil domuzlardan (örneğin yakındaki bir mezbahadan) 8-10 beyin toplayın ve bunları buz üzerinde laboratuvara taşıyın. Hayvanın sonlandırılmasından sonraki 2-3 saat içinde aşağıdaki saflaştırma prosedürüne başlamanızı öneririz.
- Beyinleri steril bir akış tezgahına yerleştirin ve buz üzerine yerleştirilmiş bir beherde 1 L PBS ile nazikçe yıkayın.
- İnce uçlu forseps kullanarak meninksleri bir seferde bir beyinden dikkatlice çıkarın ve meninkssiz beyinleri, buz üzerine yerleştirilmiş PBS ile başka bir 1 L'lik behere aktarın. Alınan sürenin uzatılması, kaldırma işlemini zorlaştırabilir. Her beyin için kullanılan yaklaşık süre 10-15 dakika olmalıdır.
- Bir neşter kullanarak, her seferinde bir beyindeki gri maddeyi kazıyın ve izole edilen materyali buz üzerine yerleştirilmiş 20 mL DMEM Besin Karışımı F-12 (DMEM / F-12) içeren Petri kaplarına (8,8 cm2) aktarın. Beyaz madde malzemesini çekmeden mümkün olduğunca fazla gri maddeyi izole edin. İlk parçalanma için, gri madde malzemesini iğnesiz 50 mL'lik bir şırıngadan geçirin. Tüm beyinler için devam edin ve toplanan gri madde materyalini bir araya getirin. Alınan sürenin uzatılması, kaldırma işlemini zorlaştırabilir. Her beyin için kullanılan yaklaşık süre 10-15 dakika olmalıdır.
- İzole edilmiş gri madde malzemesini, DMEM/F-12 ortamı ile 50/50 oranında elde tutulan bir doku homojenizatörünün öğütücü tüpüne aktarın. Gevşek bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş yaparak, ardından sıkı bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş yaparak malzemeyi homojenize edin. İzole edilen tüm malzeme homojenize olana kadar devam edin, ardından homojenatı 500 mL'lik bir şişeye aktarın ve DMEM/F-12 ile yaklaşık 450 mL toplam hacme seyreltin.
- Homojenatı, filtre tutuculu ve 140 μm filtre gözenekli 500 mL'lik mavi kapaklı bir şişe kullanarak filtreleyin ve dokuyu filtreden geçirerek kılcal damarları izole edin. Her 50 mL homojenat için bir filtre kullanın ve daha sonra her filtreyi DMEM/F-12 ile yıkayın.
- Kılcal içeren filtreleri, tripsin / EDTA (% 2.5 tripsin, PBS'de 0.1 nM EDTA), kollajenaz CLS2 (2.000 U / mL) ve DNaz 1 (3.400 U / mL) sindirim çözeltisi ile Petri kaplarına yerleştirin. 3 filtre ağı başına 1 Petri kabı (8,8 cm2, 20 mL çözelti) kullanın.
- Petri kaplarını 37 °C'de 1 saat boyunca 180 rpm'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin veya her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın. 1 saat sonra, 1 mL'lik bir pipet kullanarak Petri kabından süspansiyon ile filtrelerdeki kılcal damarları yıkayın.
- Süspansiyonu 3 tabaktan 2 adet 50 mL'lik tüpe bölün ve her 50 mL'lik tüpe 10 mL DMEM / F-12 ekleyerek sindirimi durdurun.
- Hücre süspansiyonlarını 250 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süper natanları aspire edin ve her peleti 10 mL DMEM / F-12 içinde yeniden süspanse edin. Her tüpe 20 mL daha DMEM / F12 ekleyin. Bu santrifüj adımını iki kez tekrarlayın.
- Tüpleri 5 dakika buz üzerinde soğumaya bırakın ve solüsyonları 2 yeni 50 mL tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonlarını 250 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve her peleti FBS'de% 10 DMSO'dan oluşan 8 - 10 mL (yaklaşık 1 mL / beyin kullanılır) dondurma çözeltisinde yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu, kriyovial başına 1 mL kullanarak kriyoviallere aktarın. Ortalama olarak, saflaştırma, kullanılan beyin başına 1 flakon ile sonuçlanır ve ortalama olarak 12-16 ek için endotel hücreleri sağlar. Şişeleri -80 °C'de en az 4 saatten gece boyunca bir dondurma kutusuna koyun. Daha sonra, kriyoviyalleri sıvı nitrojen içeren bir kriyotankta saklayın.
Dikkat: Sıvı nitrojen son derece düşük sıcaklıklara sahiptir. Lütfen uygun koruma kullanın.