Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Brzica, H., et al,. Yeni izole edilmiş sıçan beyni mikro damarlarından membran örnekleri hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol için prosedürel akış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Prosedür için Kurulum

1. Beyin mikrodamar tamponunu (BMB) hazırlayın. 54.66 g D-mannitol, 1.90 g EGTA (Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ', N '-tetraasetik asit) ve 1.46 g 2-amino-2- (hidroksimetil) -1,3-propandiol (yani, Tris) bazını temiz bir behere tartarak başlayın. 1.0 L deiyonize su ekleyin. BMB tamponunun bileşenlerini manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırın. Çözelti iyice karıştırıldıktan sonra, 1.0 M HCl kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
2. Hayvanları uyuşturmadan önce% 26 dekstran (MW 75.000) solüsyonu (a / h) hazırlayın. Dekstran çözeltisini hazırlamak için aşağıdaki adımları izleyin.
   not: Bu çözeltiyi önceden hazırlamak çok önemlidir, çünkü dekstranın sulu bir tamponda çözünmesi yaklaşık 1.5-2 saat sürebilir.
   1. Toz haline getirilmiş dekstranı (100 mL tampon başına 26 g) temiz bir behere tartın.
   2. Uygun BMB hacmini ölçün ve ayrı, temiz bir behere dağıtın.
   3. BMB'yi yavaşça toz haline getirilmiş dekstran içeren behere dökün. BMB'nin dökülmesi sırasında, toz haline getirilmiş dekstranı bir cam karıştırma çubuğu kullanarak manuel olarak karıştırın.
   4. Kullanmadan hemen önce pH'ı 1,0 M HCl ile 7,4'e ayarlayın.
      not: 12 ayrı Sprague-Dawley sıçanından (erkek veya dişi; 3 aylık; her biri 200-250 g) beyin mikrodamarlarının tipik bir izolasyonu 200 mL dekstran çözeltisi gerektirir (ör., 200 mL BMB'de 52 g dekstran).

2. Sprague-Dawley Sıçanlarından Beyin Dokusunun Çıkarılması

1. İstenen deneysel tedaviyi takiben, ketamin (50 mg / kg; 2.5 mL / kg ip) ve ksilazin (10 mg / mL; 2.5 mL / kg I, p.) kullanarak Sprague-Dawley sıçanlarını uyuşturun. Ketamin ve ksilazini% 0.9 salin içinde sırasıyla 20 mg / mL ve 4.0 mg / mL'lik nihai konsantrasyonlara seyreltin. IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) yönergelerine uygun olarak keskinleştirilmiş bir giyotin kullanarak hayvanları dekapitasyon yoluyla ötenazi yapın. Hem erkek hem de dişi Sprague-Dawley sıçanları için aynı prosedürü kullanın.
2. Cerrahi makas kullanarak tek bir enine kesim yaparak sıçan kafatasından cildi inceleyin.
3. Rongeur kullanarak, kafatası plakasını dikkatlice çıkarın ve beyni açığa çıkarın.
4. Bir spatula kullanarak beyni çıkarın. Beynini ayırın ve izole edilmiş beyin dokusunu 5 mL BMB içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Kullanmadan hemen önce 1.0 mL BMB tamponu başına 1.0 μL proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

3. Beyin İşleme

1. Beyin dokusunu 50 mL'lik konik tüpten temiz bir petri kabına aktarın.
2. Forseps kullanarak, serebral kortekse gevşek bir şekilde yapışmış olan dış meninksleri çıkarmak için beyni 12,5 cm çapında filtre kağıdına nazikçe yuvarlayın. Beyin dokusunu filtre kağıdına hafifçe bastırın ve dokuyu tekrar yuvarlayın. Bu adım sırasında filtre kağıdını sık sık çevirin.
3. Forseps kullanarak koroid pleksusu serebral hemisferlerden ayırın.
   not: Koroid pleksus, serebral ventriküllerin yüzeyine lokalize berrak bir membranöz doku olarak görünür.
4. Beyin dokusunu nazikçe düzleştirin ve kalan meninksleri ve koku ampullerini forseps kullanarak çıkarın.
5. Kortikal beyin dokusunu soğutulmuş bir cam havan içine yerleştirin. Harca 5.0 mL BMB içeren proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.
6. Üstten güçlü bir homojenizatör kullanarak, 3.700 rpm'de 15 yukarı ve aşağı vuruş kullanarak beyin dokusunu homojenize edin. 10 mL'lik bir havan ve havaneli doku öğütücü kullanarak homojenizasyon yapın. Her bir numunenin homojenizasyonu arasında, havaneli %70 etanol.
   kullanarak temizleyin not: Homojenizasyon vuruşları, hız ve büyüklük açısından tutarlı olmalıdır.
7. Homojenatı etiketli santrifüj tüplerine dökün.

4. Santrifüj Adımları

1. Beyin homojenatı içeren etiketli her bir santrifüj tüpüne 8.0 mL% 26 dekstran çözeltisi ekleyin.
2. Tüpü iki kez ters çevirin ve ardından numuneyi iyice girdaplayın. Beyin homojenat çözeltisinin% 26 dekstran çözeltisi ile iyice karıştırılmasını sağlamak için her bir numunenin girdaplanmasını birden fazla açı kullanarak gerçekleştirin.
3. Numuneleri 5.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
   not: Bazı analizler için beyin mikrodamarlarını beyin parankimi ile karşılaştırmak faydalı olacaktır. Beyin parankiminde protein ekspresyonunun değerlendirilmesi gerekiyorsa, bu santrifüjleme adımından gelen süpernatan (yani beyin parankimal fraksiyonu) toplanabilir ve ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de saklanabilir.
4. Bir vakum aspiratörü ve bir cam Pasteur pipeti kullanarak süpernatanı çıkarın.
   not: Peleti rahatsız etmemek için dikkatli olunmalıdır. Aksi takdirde, toplanan beyin mikro damarlarının miktarı azalacak ve bu da bu prosedürden elde edilen protein verimini önemli ölçüde azaltacaktır.
5. Peletleri 5.0 mL BMB içeren proteaz inhibitör kokteyli (ör., 1.0 mL BMB tamponu başına 1.0 μL proteaz inhibitörü kokteyli) içinde yeniden süspanse edin. İyice karıştırmayı sağlamak için peleti girdaplayın.
6. Her bir santrifüj tüpüne 8.0 mL% 26 dekstran ekleyin ve bu protokolün 4.1-4.2 adımlarında açıklandığı gibi girdap yapın.
7. Numuneleri 5.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
8. Bir vakum şişesi ve cam pipet kullanarak süpernatanı aspire edin ve beyin mikro damarını içeren peletin bozulmadığından emin olun.
   not: Tüp duvarına yapışan fazla malzeme mikro damar içermez ve dikkatlice temizlenmeli ve çıkarılmalıdır.
9. 4.5 ile 4.8 arasındaki adımları iki kez daha tekrarlayın.
10. 4 dekstran santrifüjleme adımı tamamlandıktan sonra, numuneyi yeniden süspanse etmek için her pelet ve vortekse 5.0 mL BMB ekleyin.
    not: Adım 4.10'un tamamlanmasının ardından, protein lokalizasyonunun analizi için tüm mikro damarlar toplanabilir. Bu, 50 μL'lik bir yeniden süspanse edilmiş mikrodamar peleti alikotu alarak ve bir cam mikroskop lamı üzerine bulaştırarak gerçekleştirilebilir. Mikro kaplar daha sonra bir ısıtma bloğu üzerinde 10 dakika boyunca 95 ° C'de ısıyla sabitlenir, ardından 10 dakika daha buz gibi soğuk etanolde fiksasyon yapılır. Slaytlar daha sonra görüntüleme çalışmaları için gerekli olana kadar 4 °C'de saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Sıçan beyin mikrodamarlarını izole etmek ve membran örnekleri hazırlamak için prosedürlerin ve protokollerin ana hatları

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Sigma-Aldrich	#P8340	Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	#E3889	Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
Trizma Tabanı	Sigma-Aldrich	#T1503	Beyin mikrodamar tamponunun bileşeni
Dekstran (MW 75.000)	Spektrum Kimyasal Mftg Corp	#DE125	Mikrodamarları beyin parankiminden ayırmak için santrifüjleme adımlarında kullanılan dekstran
Zetamin	MWI Hayvan Sağlığı	#501072	Genel anestezi
Ksilazin	Batı Tıbbi Tedarik	#5530	Genel anestezi
% 0.9 tuzlu su çözeltisi	Batı Tıbbi Tedarik	Yok	Genel anestezik seyreltici
Filtre Kağıdı (12,5 cm çap)	VWR (VWR)	#28320-100	Meninkslerin beyin dokusundan çıkarılması için kullanılır
Santrifüj Tüpleri	Sarstedt	#60.540.386	Dekstran santrifüjleme adımları için kullanılan tek kullanımlık tüpler
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Testi	ThermoFisher Bilimsel	#23236	Membran preparatlarında protein konsantrasyonunun ölçülmesi
Wheaton Tepegöz Güç Homojenizatörü	DWK Yaşam Bilimleri	#903475	Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir
10.0ml cam havan ve havaneli doku öğütücü	DWK Yaşam Bilimleri	#358039	Numunelerin homojenizasyonu için gereklidir
hidroklorik asit	Sigma-Aldrich	#H1758	Tamponların pH ayarlaması için gereklidir
Standart Forseps	Güzel Bilim Araçları	#91100-12	Beyin dokusunun diseksiyonu için kullanılır
Friedman-Pearson Rongeurs	Güzel Bilim Araçları	# 16020-14	Beyni izole etmek için kafatasını açmak için kullanılır
50 ml konik santrifüj tüpleri	ThermoFisher Bilimsel	#352070	İzolasyonu takiben beyin dokusunun toplanması için kullanılır
Cam Pastör Pipetleri	ThermoFisher Bilimsel	# 13-678-20C	Dekstran dönüşlerini takiben hücresel kalıntıların aspirasyonu için kullanılır
Etanol, susuz	Sigma-Aldrich	#459836	Doku öğütücüyü temizlemek için kullanılır; damıtılmış su ile% 70'e kadar seyreltilmiş
ketamin
Buz kovası

Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Belediyesi Gazetesi · Gazetesi