İnsan Nöral Kök Hücrelerinden Kortikal Piramidal Nöronların Üretilmesi

Özet

Kaynak: Gouder, L., et al,. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen piramidal nöronlardan dendritik dikenlerin üç boyutlu nicelemesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, nöral kök hücrelerin yapışmasını ve büyümesini artırmak için poliornitin ve laminin ile kaplanmış cam lamellerin hazırlanmasına yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. Teknik, nöronlarda bulunan yapıları taklit ederek nöronal hücre büyümesini ve farklılaşmasını destekleyen destekleyici bir matrisin oluşumunu kolaylaştıran sıralı inkübasyonları ve yıkamaları içerir.

Protokol

1. Nöronal Kültür
   not: Pluripotent kök hücrelerde fibroblastın yeniden programlanması, dorsal telensefalon soyuna bağlılık, geç kortikal progenitörlerin (LCP) türetilmesi, amplifikasyonu ve bankacılığı Boissart ve ark.'da tanımlanmıştır. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşması da Boissart ve arkadaşlarına göre hafif modifikasyonlarla gerçekleştirildi. Fibroblastların indüklenmiş pluripotent kök hücrelere doğrudan yeniden programlanması ve ardından nöronlara farklılaşması için başka prosedürler geliştirilmiştir. Bu protokol, piramidal glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verdiği için korunmuştur.
   1. 6 oyuklu kültür plakalarını poli-ornitin (DPBS'de (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin) içinde 1/6'ya kadar seyreltilmiş, stok konsantrasyonu% 0.01 O / N ile cam lamellerle muamele edin, ardından DPBS'de üç yıkama yapın. Daha sonra akış başlığının altına en az 10 saat laminin (stok konsantrasyonu 1 mg / ml, DPBS'de 500 kez seyreltilmiş) ekleyin.
   2. DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)/F12 (500 ml), 2 flakon (her biri 5 ml) N2 takviyesi, 2 şişe (her biri 10 ml) B27 takviyesi, 10 ml Pen-Streptomisin (Penisilin = 10.000 birim/ml ve Streptomisin = 10.000 birim/ml), 1 ml 2-merkaptoetanol (Stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1/500), büyüme faktörleri olmadan. KRİTİK ADIM: Hücre kümelenmesini azaltmak için yavaş dönen hareketlere sahip hücreler ekleyerek bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.
   3. Kültür ortamını çıkarın. Nöronu cam lamellere bağlı tutmak ve topaklanmayı önlemek için 2 μg / ml taze laminin çözeltisi içeren taze N2B27 ortamı ekleyin. Ortamı her 3 günde bir değiştirin. Hücrenin kurumasını önlemek için taze ortam eklemeden önce kalan ortamın bir kısmını (200 μl) saklayın. Alternatif olarak, hızlı bir şekilde ilerleyin ve toplam hacmi (3 ml) değiştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PD-PBS (1X), sans Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol Kırmızısı	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	14190169
Poli-L-Ornitin Çözeltisi Biyoreaktif	Sigma Aldrich	P4957 Serisi
Fare laminini	Dutscher Dominique	354232
N2 Takviyesi	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	17502048
B-27 Takviyesi, vit A olmadan (50X)	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	12587010
DMEM/SOMUN. KARIŞIM F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	31331028
Nörobazal Med SFM	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	21103049
2-merkaptoetanol	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	31350-010
Kalem-Steptomisin	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	15140-122
Kapak camı 13 mm	VWR (VWR)	631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI	Gibco/ Yaşam Teknolojileri	P36931 Serisi
Tween(R) 20 Bioextra, Viskoz Sıvı	Sigma Aldrich Chimie	P7949 Serisi
İnsan Fibroblastları	Coriell Hücre Hattı Biyodeposu	GM 4603 ve GM 1869	Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Camden, NJ, ABD
CO2 inkübatörü
6 kuyulu kültür plakası
Piptette (Türkçe)