Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Dilimleme için Fareye Hazırlık ve Beynin Çıkarılması
- Perfüzyon ve dilim inkübasyonu için hazırlanın.
- Dilimlemeden yaklaşık 30 dakika önce, kayıt veya görüntülemeden önce dilimin inkübasyonu için yüksek sükroz kesme solüsyonu ve düşük kalsiyumlu yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın.
- Perfüzyon ve dilimleme için gerekli tüm aletleri (büyük künt uçlu makas, küçük yaylı makas, anatomik forseps, büyük makas veya giyotin, iris makası, kuyumcu forsepsi, 27G x 1/2 inç iğneli 10 ml şırınga, küçük parça 1 cm x 2 cm filtre kağıdı ve dilim transferi için kırık uçlu Pasteur pipeti) yerleştirin, ve perfüzyon tepsisini hazırlayın.
- 32 ° C'likbir su banyosunda oksijenli aCSF ile inkübasyon odası ve kesme çözeltisi ile doldurulmuş bir kültür kabı kurun.
- Dilimleme için kesme aşamasını hazırlayın.
- Beyin için bir destek noktası olarak kullanmak üzere yaklaşık 1cm3 3 ve inferior colliculus'u (IC) desteklemek için kullanılacak bir yumru için 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm'lik küçük bir %3 agar parçası kesin.
- Arka durdurucuyu siyanoakrilat yapıştırıcı ile sahneye ve ayrıca arka durdurucunun sağ tarafındaki çıkıntıyı 80° 'lik bir açı oluşturacak şekilde yapıştırın.
- Beyni çıkarın.
- Doğum sonrası 12. gün (p12-p20, ideal olarak p14-18) fareyi ketamin 100 mg / kg ve ksilaksin 3 mg / kg (veya karşılaştırılabilir etik kurul onaylı prosedür) ile derinlemesine anestezi altına alın><.
not: Ayak parmağınızın sıkışmasına yanıt verilmemesi nedeniyle uygun anestezi seviyesini onaylayın. Hayvan kısa bir süre anestezi altında olduğu için oftalmik merhem gereksizdir.
- Künt uçlu makas kullanarak, göğüs kafesini ksifoid işleminden boyuna kadar ortaya çıkarın.
- Ksifoid işlemini bulun ve yaklaşık 1,5 cm'lik yatay bir kesim yapın.
- Önceki yatay kesimin uçlarından omuzlara kadar, her biri yaklaşık 1,5 cm olacak şekilde iki dikey kesim yapın.
- Kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı ve kostokondral bağlantıları kesin.
- Küçük yaylı makasla, kalbin ventral tarafından dorsal tarafına kadar sağ atriyumda 2-5 mm'lik küçük bir kesi yapın.
- 27G x 1/2 inç iğneli 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, sol ventrikülü enjekte edin ve hayvanı yüksek sükroz kesme çözeltisi ile hızlı bir şekilde perfüze edin.
- Kan berraklaştığında, kafayı çıkarmak için daha büyük bir makas kullanın.
not: Perfüzyonun faydasını sistematik olarak değerlendirmedik. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, bu genç farelerde transkardiyak perfüzyon yaklaşık% 100 başarı ile yapılabilir ve floresan yapabilen ve görüntülemeye müdahale edebilen kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırma avantajına sahiptir.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi orta hattan kesin.
- Bükülmüş iris makası kullanarak kafatasını gözler arasında kesin, ardından gözler arasındaki kesikten başlayarak, alttaki beyne zarar vermemeye dikkat ederek orta hat sütürü boyunca önden arkaya doğru dikkatlice kesin.
not: Dura genellikle kafatası ile birlikte çıkar. Gerekirse, beyni dikkatlice çıkarmadan önce durayı çıkarın.
- Kuyumcu forsepslerini kullanarak kafatasını kaldırın ve beyni dikkatlice çıkarın, ardından beyni kesme solüsyonuna yerleştirin. Kortekslere zarar vermemeye özen gösterin.
2. Beyni Dilimlemeye Hazırlama
- Vibratom aşamasına montaj için beyni hazırlamak.
- Sol üstten sağ alta doğru 90° C'de iki çizgi ve 17° C'de çapraz bir çizgi ile işaretlenmiş bir slayt kullanarak, iki çizginin birleştiği yerde kesişerek, beyin sırt tarafını yukarı gelecek şekilde yerleştirin, bir tıraş bıçağı kullanarak, rostral uç beynin 2-4 mm'sini çıkarın ve düz bir yüzey oluşturun.
- Beynin kuyruk tarafı yukarı bakacak şekilde yeni oluşturulan düz yüzeye yerleştirin ve beynin sırt yüzeyini yatay ve beynin orta hattı ile dikey çizgi ile hizalayın.
- Tıraş bıçağını 17° C çizgi ile hizalayın, tıraş makinesini 30° 'lik bir açıyla eğin ve çift çapraz kesimde (yatay düzlemden 17o ve koronalden 60 ° C) sağ korteksin yaklaşık 3mm'sini çıkarın.
- Beyni vibratom aşamasına monte etmek.
- Beynin ventral tarafına 1 cm x 2 cm'lik küçük bir filtre kağıdı parçası yerleştirin, böylece uzun boyut orta hatta dik olur.
- Arka durdurucunun önündeki alana (ve çıkıntının soluna) az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.
- Çapraz olarak kesilmiş çift beyin yüzünü, beynin ve arka beynin kaudal kısmı tümseğe dayanacak ve beynin sağ tarafı geri tepmeye dayanacak şekilde yapıştırıcının üzerine yerleştirin.
- Beyne hassas bir şekilde bastırın ve tüm yüzeyin dilimleme haznesi ile temas halinde olduğundan emin olun.
>3. Kollikülo-talamokortikal Dilimin Elde Edilmesi
- Kesme aşamasını hızlı bir şekilde alın ve vibratomun içine yerleştirin, sahneyi kesme solüsyonu ile doldurun.
- Bıçağı beynin üst kısmı (ventral tarafı) ile hizalayın.
- Beynin üstünden 1-1,5 mm çıkarın, 300-500 μm'lik dilimleri çıkarın ve çıkardıktan sonra derinliği değerlendirin.
Not: IC, medial genikülat cisim (MGB) ve lateral genikülat çekirdek (LGN) görünür olduğunda ve dentat girus bir 'C' şekli oluşturduğunda bir ila iki 600 μm'lik dilim alır. Şekil 1A'ya bakın.
- Dilimleri ısıtılmış (32 oC) tutma haznesine yerleştirin.
