Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Nöromüsküler Kavşakların İn Vitro İndüksiyonu

Özet

Kaynak:Lin, C. et al., İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden İndüklenen İn vitro Nöromüsküler Kavşak. (2020).

Bu deney, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden nöromüsküler kavşaklar oluşturmak için bir yöntemi detaylandırıyor. Miyotüp ve motor nöron gelişimini ve sinaps oluşumunu teşvik etmek için aşamalı bir farklılaşma süreci kullanır ve fonksiyonel nöromüsküler kavşaklar sağlar.

Protokol

1. Hücre dışı matris (ECM) kaplı plakaların hazırlanması

1. ECM'yi (Malzeme Tablosuna bakın) buz gibi soğuk 1x PBS ile %2'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin
2. 50 mL'lik bir plastik tüpte 49 mL 1x PBS'ye 1 mL ECM ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
3. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 lamel yerleştirin. Her kuyucuğa 1.5 mL% 2 ECM ekleyin.
4. Kuyucuk plakasını 37 ° C'de 2 saat boyunca% 2 ECM ile inkübe edin.
5. ECM'yi kuyu plakasından aspire edin ve kullanmadan önce plakayı 4 °C'de saklayın.

2. iPSC'lerin NMJ'ye doğru farklılaşması

1. Bölüm 1'de hazırlanan 6 oyuklu plaka üzerinde oyuk başına 4 x^{10 5} iPSC tohumlayın. Kuyuya önceden bırakılmış lamel üzerindeki hücreleri tohumladığınızdan emin olun.
   not: Bu çalışmada 201B7^MYOD iPS hücre hattı kullanılmıştır.
   1. Ortamı 6 cm'lik kültür kabındaki iPSC'lerden çıkarın ve iPSC'leri 1x PBS ile bir kez yıkayın.
   2. Tabağa 1 mL hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
   3. Tabağa 3 mL primat embriyonik kök (ES) hücre ortamı ekleyin ve 3 kez hafifçe pipetleyin.
   4. Ayrılmış iPSC'ler içeren süpernatanı 50 mL'lik bir plastik tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 160 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, iPSC'leri 10 μM Y27632 ile 3 mL primat ES hücre ortamında yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
   6. iPSC'leri primat ES hücre ortamı ve 10 μM Y27632 ile 2 x 10⁵ hücre / mL konsantrasyona seyreltin. Bölüm 1'de açıklanan kuyucukta önceden biriktirilmiş lamel üzerine 2 mL iPSC ekleyin.

3. iPSC'lerin NMJ'ye indüksiyonu

1. 1. günde, iPSC'leri 6 oyuklu plakaya tohumladıktan 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın ve her oyuğa 1 μg / mL doksisiklin içeren 2 mL taze primat ES hücre ortamı ile değiştirin.
2. Ortamı, her oyuğa 1 μg / mL doksisiklin (nihai konsantrasyon) içeren 2 mL miyojenik farklılaşma ortamı (MDM) (Tablo 1) ile değiştirin. Ortamı 2. günden 10. güne kadar her gün yenileyin.
3. 11. günden itibaren, ortamı her bir kuyucuğa 2 mL NMJ ortamına (Tablo 1) geçirin. Ortamı her 3 günde bir, daha sonra 30. güne kadar yenileyin.
4. 30. günde faz ters mikroskopi ile farklılaşmış NMJ'yi gözlemleyin. NMJ aşağıdaki analiz için kullanılabilir.

Sonuçlar

Tablo 1: Ortamın formülü.

TL ...

Miyojenik farklılaşma ortamı (MDM)	MEM-alfa	500 milyon
	100mM 2-ME	1117μL
	Doksisiklin	1μg/mL
	Kurtuluş	56 mL (finalden %10'a kadar)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ortam, büyüme faktörleri ve reaktifler
2-merkaptoetanol	Nacalai tesque	21418-42
B27, Gibco	Gibco (Gibco)	12587-001
BDNF (BDNF)	Ar-Ge Sistemleri	248-BD
Hücre ayırma çözümü, Accumax	KÖK HÜCRE Teknolojileri	#07921
Kritik nokta kurutucu	Hitachi	ES-2030
Doksisiklin	Takara	631311
ECM, Matrigel (büyüme faktörü azaltılmış)	Corning	356230
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	Ar-Ge Sistemleri	212-GD
Jelleşme, IP jel	Geno Personeli	PG20-1
İyon kaplayıcı	JEOL	JEC3000FC
iPSC ortamı, mTeSR	KÖK HÜCRE Teknolojileri	85850
Nakavt SR (KSR)	Gibco (Gibco)	10828-028
Canlı hücre mikroskobu	Nikon		Eclipse Ti mikroskobu
MEM-alfa	Gibco (Gibco)	12571-071
N2, Gibco	Gibco (Gibco)	17502-048
Nörobazal ortam	Gibco (Gibco)	21103-049
NT3	Ar-Ge Sistemleri	267-N3
Primat ES hücre ortamı	ReproCell (Yeniden Hücre)	RCHEMD001
Sem	Hitachi	S-4700 Zırhlı Uçak Gemisi
Tem	Hitachi	H7650
Y27632	Wako Kimyasallar GmbH	253-00513