Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deney Düzeneği
- Doku ve hücre toplamaya başlamadan önce, tüm aletlerin steril olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, bir çift keskin cerrahi makas, bir çift çok ince forseps ve bir çift ince standart forseps otoklavlayın. Ayrıca, uygun olduğu şekilde, UV sterilizasyonu, etanole maruz kalma veya buhar sterilizasyonu kullanarak hücre tohumlamadan önce her bir substratı sterilize edin.
- Nöron hasadı ve ayrışması için besiyeri ve stok solüsyonlarının hazırlanması
- Ham'ın F12 ortamına %1 penisilin-streptomisin (PS) ve %1 N2 takviyesi ekleyerek Bottenstein ve Sato'nun (BS) ortamını hazırlayın. Kuyucuk başına 500 μl olarak gereken nihai hacmi hesaplayın (24 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa).
- Ham'ın F12 ortamında ağırlıkça% 1.25 / v konsantrasyonunda kollajenaz IV stokları hazırlayın. Çözeltiyi filtreyle sterilize edin ve -20 ° C'de 200 μl alikot olarak saklayın.
- Sığır pankreas tripsin stoklarını Ham'ın F12 ortamında ağırlıkça% 2.5 / v konsantrasyonunda hazırlayın, filtreden sterilize edin ve -20 ° C'de 200 μl alikot olarak saklayın.
- Sinir büyüme faktörü (NGF) stok solüsyonunu, F12 ortamında filtreyle sterilize edilmiş 1 mg / ml yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (BSA) solüsyonunda 5 μg / mL konsantrasyonda hazırlayın ve -20 ° C'de 200 μl alikotlar olarak saklayın. Sulandırıldıktan sonra NGF'yi filtrelemeyin.
- Herhangi bir yüzey modifikasyonu yapılmamışsa, lamelleri/plakaları poli-D-lizin (oda sıcaklığında [RT] 15 dakika boyunca 0.1 mg / ml) ve / veya laminin (37 ° C'de 2 saat boyunca 2-10 μg / cm2) ile kaplayın nöron bağlanmasını ve nörit büyümesini uygun şekilde desteklemek için.
- Kullanmadan önce ortamı daima 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. Dorsal Kök Gangliyonları (DRG) Nöronlarının Toplanması ve Ayrışması
- Sıçanı servikal dislokasyon ve dekapitasyon ile sonlandırın. Fareyi tıraş edin ve omurgayı ortaya çıkarmak için cildi kaldırın. Keskin bir makas kullanarak, sınırlı organlara ve kan damarlarına daha fazla özen göstererek omurgayı çıkarın. Omurgayı bir Petri kabı kullanarak biyolojik bir güvenlik kabinine (sınıf II) aktarın ve herhangi bir sırt parçasını çıkarın.
- Kord dokusunu ortaya çıkarmak için steril ve keskin cerrahi makas kullanarak omurgayı uzunlamasına eksen boyunca ikiye bölün. Bu noktada, DRG nöron hasadı sırasında kullanımı kolaylaştırmak için omurgayı göğüs kafesi seviyesinin altında iki küçük segmente kesmek faydalı olacaktır. İnce forseps kullanarak, DRG köklerini çekmemeye ve çıkarmamaya dikkat ederek tüm kordon dokusunu nazikçe çıkarın. Bu şekilde DRG ve kökler, hala kolon içinde bulunan vertebral kanallar içinde açığa çıkacaktır. DRG'yi doğrudan kanallardan çıkan beyaz filamentler olarak gözlemleyin.
- Çok ince forseps kullanarak, omur kanallarının derinliklerine inerek ve ganglionların köklerine zarar vermemeye dikkat ederek tüm DRG kökünü (sadece DRG'yi değil) vertebral kanallardan dışarı çekin. DRG'yi, %1 PS ile desteklenmiş 3-4 ml Ham F12 ortamı içeren küçük bir petri kabına (60 mm2) aktarın. Farklı hayvanlar kullanıyorsanız, ayrı yemekler kullanın.
- Diseksiyon mikroskobu altında, glial hücre kontaminasyonunu azaltmak için steril forseps ve bir neşter kullanarak gangliyonları çevreleyen fazla sinir köklerinin DRG'sini temizleyin. DRG'yi 1,8 ml taze F12 ortamı içeren küçük bir petri kabına (35 mm2) aktarın.
- 200 μl ağırlıkça %1.25 kollajenaz tip IV stok çözeltisi (nihai konsantrasyon %0.125) ekleyin ve DRG'yi 37 °C, %5CO2'de 1 saat inkübe edin. DRG'yi aspire etmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin. Ağırlıkça% 0.125 / v kollajenaz tip IV enzimi ile desteklenmiş taze F12 ortamı ekleyin ve daha önce tarif edildiği gibi 1 saat inkübe edin.
- Ortamı aspire edin ve DRG'yi F12 ortamı ile nazikçe yıkayın. Daha sonra 1.8 ml F12 ortamı ve 200 μl tripsin (nihai konsantrasyon ağırlıkça %0.25/v) ekleyin ve 37 °C, %5CO2'de 30 dakika inkübe edin.
- Tripsini çıkarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 μl fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş 1 ml F12 ortamı ekleyin. Ortamı aspire edin ve serum kalıntılarını gidermek için DRG'yi F12 ortamı ile üç kez nazikçe yıkayın.
- 2 ml taze F12 ortamı ekleyin ve DRG'yi ortamla birlikte bir cam pipet kullanarak 15 ml'lik bir tüpe dikkatlice aktarın. Cam pipetle yukarı ve aşağı (yaklaşık 8-10 kez) pipetleyerek DRG nöronlarını nazikçe ayırın (alternatif olarak plastik uçlar kullanılabilir).
- Peletin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve ortamı yeni bir tüpte toplayın. Pelet içeren tüpe 2 ml taze F12 besiyeri ekleyin ve mekanik ayrışmayı cam pipet ile tekrarlayın. Süspansiyon homojen hale gelene kadar (yaklaşık 3-4 kez) bu adımı tekrarlayın ve tüm ayrışmış DRG'yi yeni tüpte toplayın. Bu yöntem, mekanik ayrışmadan kaynaklanan stresi azaltır ve nöronların canlılığını artırır.
- Elde edilen homojenize süspansiyonu, ayrışmamış nöronları ve diğer kalıntıları gidermek için 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak 15 ml'lik yeni bir tüpe süzün. Bu aşamada, önce hücre süspansiyonunu 50 ml'lik bir tüpe filtrelemek ve daha sonra çözeltiyi bir cam pipet kullanarak daha küçük tüpe aktarmak uygun olabilir. Süspansiyonu 110 g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- 500 μl F12 ortamına 500 μl %30 BSA çözeltisi ekleyerek %15'lik bir BSA hazırlayın. Kademeli bir protein izi oluşturmak için çözeltiyi 15 ml'lik bir tüpün duvarından yavaşça pipetleyin. Bu aşamada, tüpü 45°'lik bir açıyla tutmak ve şekillendirme "izi" için referans olarak şahin tüpü üzerindeki sayıları kullanarak BSA'yı yavaşça serbest bırakmak faydalı olacaktır.
- Tüpün dibinde 500 μl bırakarak süpernatanı adım 2.10'dan itibaren aspire edin ve hücre peletini aynı ortamda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu daha önce adım 2.11'de hazırlanan protein izi boyunca yavaşça pipetleyin (tüp üzerindeki sayıları referans olarak kullanın) ve 500 g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 ml modifiye BS ortamında yeniden süspanse edin.
not: DRG nöronlarını yeniden süspanse etmek için gereken hacim, istenen nihai hücre konsantrasyonuna ve tohumlanacak numune sayısına bağlı olarak gereken gerçek hacme kadar yapılabilir. Bir hayvan, 24 oyuklu bir plaka deneyi için yeterli hücre sağlayacaktır.
- Tohumlanmış numuneleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de hücre bağlanmasına izin vermek için 2 saat inkübe edin ve son olarak 50 ng / ml NGF ile desteklenmiş taze BS ortamı ekleyin.
