1. Kök Hücre Bakımı
>NOT: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, yapışık bir tek tabakada tutulan pluripotent kök hücreler (PSC'ler) için geçerlidir. Dimetil sülfoksit (DMSO) işleminden önce kullanılan ortam, diğer reaktifler ve hücre kültürü plakaları gerektiği gibi ayarlanabilir. Bu yazıda yer alan aşağıdaki tüm protokoller için, hücreler bir biyolojik güvenlik kabini altında ele alınmalıdır.
- Steril, 6 kuyulu, doku kültürü ile muamele edilmiş plakaları, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış pluripotent kök hücre nitelikli bir matris veya substrat ile kaplayın ve bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, nemli atmosfer) en az 1 saat inkübe edin. Kaplamalı plakalar filmle sarılabilir ve 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
- Dondurularak saklanmış PSC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün. Biyolojik güvenlik kabinine girmeden önce şişeyi etanol ile sterilize edin, ardından hücreleri hemen pipetleyerek 5-10 hacim önceden ısıtılmış kök hücre ortamı içeren steril bir konik tüpe aktarın.
- Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Ortamı aspire edin ve Y-27632 gibi 10 μM rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL kök hücre ortamında hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin.
- Kültür matrisini plakadan aspire edin ve hücreleri istenen yoğunlukta, tipik olarak oyuk başına 0.5-1 x10 6 hücre, oyuk başına en az 2 mL kök hücre ortamında tohumlayın.
not: Kaplama yoğunluğu, farklı hücre hatları ve klonlar arasında değişebilir ve buna göre optimize edilmelidir.
- Günlük olarak önceden ısıtılmış kök hücre ortamı ile değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca %70-80 oranında birleştiğinde veya hücre kolonileri temas etmeye başladığında bölün.
- Hücreleri bölmek için, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücreleri 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca oyuk başına 1 mL bir ayrışma enzimi çözeltisi ile inkübe edin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış kök hücre ortamı ile yıkayın ve yeniden süspanse edin ve 5-10 hacim kök hücre ortamı içeren steril bir konik tüpe aktarın. Hücreleri kaplamak için 1.3-1.7 adımlarını izleyin.
2. DMSO Ön Arıtma
NOT: Farklılaşmadan önce hücreleri DMSO ön işlemi için kaplarken, başlangıç kaplama hücresi yoğunluğu, kök hücre hattının tipik büyüme hızı ve kullanılan farklılaşma protokolü dikkate alınarak optimize edilmelidir. Gerektiği gibi geleneksel işaretleyicileri kullanarak pluripotensi doğrulayın. Hücreler, farklılaşmadan önce ilk çözülmeden sonra en az 1x-2x geçilmelidir.
- 2D kültür farklılaştırması
- Hücreler uygun bir birleşim noktasına ulaştığında, kaplanmış plakalar hazırlayın, hücreleri ayırın ve yukarıda tarif edildiği gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
- Canlı hücreleri, tripan mavisi veya başka bir canlılık belirteci dahil olmak üzere bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayın.
- Hücreleri, 10 μM ROCK inhibitörü ile kök hücre ortamında oyuk başına 0.5-1 x10 6 hücrede kaplanmış 6 oyuklu bir plaka üzerine plakalayın.
NOT: Laboratuvarımızda test edilen hücre hatları için, bu yoğunluklar tipik olarak 24 saatlik DMSO ön işlemi içinde% 80 -% 90 birleşik hücrelerle sonuçlanmıştır.
- Hücrelerin bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 24 saat inkübe etmesine izin verin.
- Önceden ısıtılmış kök hücre ortamında% 1 -% 2 DMSO hazırlayın (ör., 10 mL ortamda 100 μL DMSO =% 1 DMSO çözeltisi veya 10 mL ortamda 200 μL DMSO =% 2 DMSO çözeltisi).
- 24 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı hücrelerden aspire edin ve DMSO çözeltisi ile değiştirin.
- Farklılaşmadan önce hücrelerin bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 24 saat ila 48 saat inkübe etmesine izin verin.
NOT: Tipik olarak, insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (ESC ve iPSC) hatlarının çoğunda 24 saatlik bir DMSO tedavisi yeterlidir. Çok yavaş büyüme oranlarına (uzun ikiye katlama süreleri) sahip hücre hatları, DMSO ile 48 saatlik inkübasyondan yararlanabilir. DMSO ile 48 saatlik bir inkübasyon için, ilk 24 saatlik tedaviden sonra ortam% 1 -% 2 DMSO içeren taze kök hücre ortamı ile değiştirilebilir.
3. Birincil Germ Katmanlarına Farklılaşma
NOT: Aşağıda, daha önce laboratuvarımızda 6 oyuklu plaka üzerinde tek tabaka halinde büyütülen PSC'ler için etkili olduğu gösterilen yöntemler açıklanmaktadır. İstenen soylara farklılaşmayı teşvik etmek için DMSO tedavisinden sonra tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü kullanılmalıdır. 24-48 saatlik bir tedaviden sonra DMSO çözeltisini çıkarın ve standart protokolleri izleyerek farklılaşmaya devam edin.
- Ektoderm farklılaşması
- Hücreleri, 2D kültürler için yukarıda tarif edildiği gibi DMSO ile ön işlemden geçirin.
- Noggin ve SB431542 stok çözeltilerini hazırlayın.
- Nakavt serum replasmanını (KOSR) nakavt Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10'luk bir nihai konsantrasyona çözerek ektodermal farklılaşma baz ortamını hazırlayın.
not: 3-4 günlük medya değişimi için yeterli temel medya hazırlayın.
- Noggin'i 500 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyerek ve uygun önceden ısıtılmış KOSR / nakavt DMEM hacmine 10 μM'lik bir nihai konsantrasyona SB431542 ekleyerek ektodermal farklılaşma ortamı hazırlayın.
- DMSO ön işleminden sonra, hücrelerden ortamı aspire edin ve farklılaşma ortamı ile değiştirin (ör., 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL).
- Hücrelerin bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 3-4 gün inkübe etmesine izin verin ve ortamı günlük olarak yeni eklenen farklılaşma faktörleriyle değiştirin.