$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Diseksiyon Tamponları ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması
- Sıçan omuriliğinin izolasyonu için 100 ml diseksiyon tamponu (1x PBS +% 0.6 glikoz +% 2 penisilin-streptomisin) hazırlayın ve soğutun.
- 100 ml serumsuz ortam (SFM) hazırlayın ve 37 °C'de ısıtın. SFM'yi hazırlamak için Neurobazal-A ortamına 2 mM L-glutamin, 100 μg/ml penisilin-streptomisin, %2 B27 ve %10 hormon karışımı ekleyin. Hormon karışımı hazırlamak için,% 0.6 glikoz, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 μg / ml insülin, 100 μg / ml apo-transferrin, 10 μM putresin içeren 1: 1 DMEM / F12 ortamı yapın, 30 nM selenyum ve 20 nM progesteron.
- EFH büyüme faktörü ile zenginleştirilmiş kaplama ortamını hazırlayın (SFM'ye 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF ve 2 μg/ml heparin ekleyin) ve 37 °C'de ısıtın.
2. Erişkin Sıçan Periventriküler Omurilik Dokusunun Çıkarılması ve Diseksiyonu
- Diseksiyon aletlerini etanolde sterilize edin ve steril tuzlu su içinde veya otoklav aletlerini önceden durulayın. Sıçanlara (6-8 haftalık) öldürücü bir sodyum pentobarbital enjeksiyonu (65 mg / ml'de 1 cc) veya aşırı dozda anestezik (ör.% 4 izofluran) kişinin kurum onaylı hayvan protokolüne göre. Sıçanın arkasını% 70 etanol ile ıslatın ve sırt yüzeyindeki cildi büyük diseksiyon makası ile çıkarın.
- Makası sırt yüzeyine dik tutarak, vertebral kolonu arka ayakların üzerinde enine kesin. Dikenli süreçleri ortaya çıkarmak için vertebral kolonun üzerindeki sırt kasını rostral yönde uzunlamasına kesmek için daha küçük makas kullanın.
- Açıkta kalan kaudal uçtan başlayarak, omurilik ile vertebral kolon arasındaki boşluğa omurilik kanalının lateral yönüne ekstradural olarak rongeurs veya küçük bir künt kemik kesme aleti yerleştirin. Laminaya küçük kesikler atın (omurların her iki tarafındaki dikenli süreçlerin solunda ve sağında kemik kemerleri) ve omuriliği ortaya çıkarmak için laminayı dikkatlice soyun (Şekil 1A-D). Bıçakların açısının sığ ve kordona paralel olduğundan emin olun, böylece alttaki omurilik zarar görmez.
- Torasik ve servikal omuriliği ortaya çıkarmak için rostral yönde laminektomiye devam edin.
- Omuriliği vertebral kolondan künt doku forsepsleri ile nazikçe kesin ve kordonu serbest bırakmak için kökleri dikkatlice kesmek için mikro makas kullanın. Eksize edilen omuriliği 4 °C steril sıçan diseksiyon tamponu (yukarıda 1.1'de açıklanmıştır) içeren bir Petri kabına yerleştirin. Dokuyu taze hazırlanmış 4 °C diseksiyon tamponunda durulayın ve omuriliği makas kullanarak enlemesine 1 cm'lik segmentler halinde kesin (Şekil 1E).
- Dokunun her bir bölümü için, dokuyu ince forseps ile tutmak için bir elinizi kullanın. Öte yandan, üstteki meninksleri, beyaz maddeyi ve gri maddenin çoğunu bir diseksiyon dürbünü yardımıyla dikkatlice çıkarmak için mikro makas kullanın. Alternatif olarak, gri ve beyaz maddenin çoğunu soymak için ince forseps (Dumont # 4) kullanın, geriye sadece ependima ve az miktarda çevreleyen gri madde içeren omuriliğin periventriküler bölgesi kalır (Şekil 1F-H).
- Diseke edilmiş periventriküler dokuyu soğuk sıçan diseksiyon tamponu içeren 10 cm'lik steril bir Petri kabına koyun.
3. Yetişkin Sıçan Omurilik NSPC'lerinin İzolasyonu ve Kültürü
- Aşağıdaki adımları laminer akış başlığında aseptik olarak gerçekleştirin.
- Diseke sıçan periventriküler dokusunu mikromakasla 1 mm'lik parçalar halinde kıyın.
- Malzemeler/reaktifler tablosunda belirtildiği gibi papain ayrışma kitini kullanarak kıyılmış dokuyu proteolitik enzimlerle enzimatik olarak ayırın.
not: Reaktif bileşenleri dört şişe içerir: Flakon 1: Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS). Flakon 2: L-sistein ve EDTA içeren papain. Flakon 3: Deoksiribonükleaz I (DNaz). Flakon 4: Sığır serum albümini (BSA) ile ovomukoid proteaz inhibitörü.
NOT: Papain, protein substratları için geniş özgüllüğe sahip bir sülfhidril proteazdır. Buradaki papain, Carica papaya bitkisinin lateksinden elde edilir ve çoğu protein substratını pankreas proteazlarından daha kapsamlı bir şekilde bozar. Ayrışma işlemi sırasında, DNA'nın ayrışma ortamına salınmasına neden olan bir miktar hücre hasarı vardır, bu da viskoziteyi artıracak ve pipetlemeyi zorlaştıracaktır. Böylece DNaz, sağlam hücrelere zarar vermeden DNA'yı sindirmek için hücre izolasyon prosedürüne dahil edilir. Ovomucoidler, ayrışma adımından sonra papain aktivitesini inhibe etmek için kullanılan glikoprotein proteaz inhibitörleridir.
- İlk kullanımda, albümin ovomokoid inhibitör karışımını (flakon 4) 32 ml EBSS (flakon 1) ile sulandırın ve daha sonra 4 ° C'de saklayın ve sonraki izolasyonlar için kullanın. not: Bu, ml başına 10 mg ovomukoid inhibitörü ve 10 mg albüminin etkili bir konsantrasyonunda bir çözelti verir.
- Papain şişesine (şişe 2) 5 ml EBSS (şişe 1) ekleyin, 0.5 mM EDTA ile 1 mM L-sistein içinde 20 birim papain / ml'de bir çözelti elde edin. Papain çözeltisinin tamamen çözüldüğünde berrak göründüğünü kontrol edin. Aksi takdirde, enzimin toplam aktivitesini sağlamak için şişeyi papain tamamen eriyene kadar on dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
- DNaz şişesine (şişe 3) 500 μl EBSS (şişe 1) ekleyin ve DNaz kayma denatürasyonuna duyarlı olduğundan hafifçe karıştırın. Papain şişesine 250 μl DNaz çözeltisi ekleyin, bu da yaklaşık 20 birim / ml papain ve% 0.005 DNaz'lık bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanır. Kalan DNAse'yi daha sonra kullanmak üzere kaydedin.
- Kıyılmış sıçan dokusunu papain solüsyonuna yerleştirin.
- Aktive edilmiş papain solüsyonundaki dokuyu ayırmak için bir külbütör platform üzerinde sürekli çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin. Sıçan dokusunu 45 dakika ila 1 saat inkübe edin.
- Bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek için kalan doku parçalarını ayırmak için karışımı 10 ml'lik bir pipetle ezin. Hücre süspansiyonunu (herhangi bir ayrışmamış doku parçası dahil etmeyin) steril 15 ml'lik bir konik tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Peletlenmiş hücreleri, bir papain inhibitörü olan ovomukoid içeren ortamda yeniden süspanse edin.
- 15 ml'lik konik bir tüpte 2.7 ml EBSS (flakon 1) ile 300 μl sulandırılmış albümin-ovomukoid inhibitör solüsyonu (flakon 4) karıştırarak ovomukoid solüsyonu hazırlayın. 150 μl DNaz çözeltisi (flakon 3) ekleyin.
- Süpernatanı peletlenmiş hücrelerden atın ve seyreltilmiş DNaz albümin inhibitörü karışımında hücre peletini hemen yeniden süspanse edin.
- Tek adımlı süreksiz yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme yoluyla sağlam hücreleri hücre zarlarından ayırın.
- 15 ml'lik bir tüpe 5 ml albümin inhibitörü çözeltisi (flakon 4) ekleyerek ve 5 ml'lik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır) albümin inhibitörü çözeltisinin üzerine nazikçe ve yavaşça katmanlayarak süreksiz yoğunluk gradyanını hazırlayın.
- RT.
'de 6 dakika boyunca 70 x g'de santrifüjleyin
not: Degradenin iki katmanı arasındaki arayüz açıkça görülebilir olmalıdır, ancak bu sınırda minimum karıştırma sonucu etkilemez. Membran fragmanları arayüzde kalır ve ayrışmış hücreler tüpün dibinde peletlenir.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 ml sıçan EFH ortamında (37 ° C'de önceden ısıtılmış) yeniden süspanse edin. Bir hemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve hücreleri EFH'de 10 hücre / μl yoğunlukta bir T25 kültür şişesine yerleştirin. Sıçan dokusundan elde edilen tipik hücre verimi, yaklaşık% 80 canlılığa sahip yaklaşık 2 x10 6 hücredir. Klonal kültürler isteniyorsa, hücreleri 10 hücre/μl'den daha az bir yoğunlukta tohumlayın. Şişeleri 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin ve kürelerin toplanmasını önlemek için kültürlerin 1 hafta boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin.
