$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Çözeltilerin hazırlanması
- 500 mL Yıkama Tamponu A (WBA) hazırlayın: Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 10 mM HEPES çözeltisi. 4 °C'de saklayın.
- HBSS'de 500 mL Yıkama Tamponu B (WBB): 10 mM HEPES çözeltisi ile% 0.1 Sığır Serum Albümini (BSA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Çözeltiyi gece boyunca oda sıcaklığında karıştırarak WBA'da 300 mL% 30 dekstran çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce çözeltiyi 110 °C'de 30 dakika otoklavlayın. Otoklavlamadan sonra çözeltiyi oda sıcaklığında 2-3 saat dinlendirin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
- Soğuk dekstran çözeltisinde 100 mL% 0.1 BSA çözeltisi hazırlayın. 3-4 dakika kuvvetlice çalkalayın ve 4 °C'de saklayın.
- %20 buzağı serumu, 2 mM glutamin, 50 μg/mL gentamisin, %1 vitamin, %2 amino asit Bazal Orta Kartal (BME) Bazal DMEM ortamında çözünerek eksiksiz Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) kültür ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce 1 ng/mL Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin.
- Perisit kültürü bazal ortamında perisit büyüme takviyeleri (perisit ortamı ile birlikte verilir) ve% 20 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ekleyerek tam perisit ortamı hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
2. Beyin dokusunun geri kazanılması ve meninkslerin çıkarılması
- Tutarlılık için, her ekstraksiyon partisinde benzer yaş ve aynı cinsiyetteki fareleri kullanın. Patojen içermeyen bir hayvan barınağı kullanın ve suya ad libitum erişim sağlayın. Hayvanların verimliliğini ve minimum kullanımını sağlamak için doku materyali kaybını önleyin.
- Ötenazi C57BL / 6J, 4-6 haftalık, erkek fareler (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Fransa).
- Beyin dokusunu steril koşullarda hızlı bir şekilde çıkarın, dokuya herhangi bir zarar vermekten kaçının. Dokuyu dikkatlice 40 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin.
- Beyin dokusunu soğuk PBS'de bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) aktarın.
- Beyin dokusunu steril, kuru, tüy bırakmayan bir mendil üzerine yerleştirin ve kavisli uçlu forseps ile beyincik, striatum ve oksipital sinirleri çıkarın.
- Görünen tüm meninksleri pamuklu çubukla çıkarın. Beyin dokusunu baş aşağı yerleştirin ve dışa doğru hafif vuruşlar kullanarak lobları pamuklu çubukla açın. Görünen tüm kan damarlarını çıkarın.
- Meninkssiz beyin dokusunu 15 mL soğuk WBB içeren bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin.
3. Homojenizasyon
- Dokuyu bir Dounce doku öğütücü harç tüpüne aktarın ve forseps ile 3-4 mL WBB ekleyin.
- Dokuyu 'gevşek' bir havaneli ile 55 kez kıyın. 'Gevşek' havaneli WBB ile durulayın. Şimdi bulamacı 25 kez "sıkı" bir havaneli ile kıyın.
- Bulamacı eşit olarak iki 50 mL tüpe bölün ve bulamacı karıştırmak için tüpleri kuvvetlice sallayarak 1.5x hacimde soğuk% 30 BSA-dekstran ekleyin.
4. Vasküler fraksiyonun izolasyonu
- Tüpleri kuvvetlice çalkaladıktan sonra, tüpleri 3.000 x g ve 4 ° C'de 25 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı (üst miyelin tabakası ile birlikte) 2 yeni tüpe aktarın ve tüpleri 3.000 x g ve 4 ° C'de 25 dakika santrifüjleyin. 3 mL soğuk WBB ekleyerek peletleri ilk santrifüjlemeden koruyun (peleti 4 ° C'de tutun).
- Adım 4.2'yi tekrarlayın ve peletleri 2. santrifüjden dikkatlice koruyun.
- Dekstran ve miyelini, adım 4.3'teki tüplerden doku kalıntıları ile atın. Peletleri soğuk WBB'de saklayın.
- Tüp 1 ve tüp 2'nin içeriğini adım 4.1'den itibaren bir araya getirin ve soğuk WBB ile 10 mL'lik son hacme kadar hazırlayın.
- Adım 4.2 ve adım 4.3.
'deki tüpler için bu adımı tekrarlayın
NOT: Son olarak, 3 santrifüjden 3 tüp vardır.
- Görünür pelet kümeleri kalmayana kadar 6 mL'lik bir pipet kullanarak 10 yukarı ve aşağı vuruş kullanarak peleti ayırın.
- Bir vakum filtre tertibatı ve bir naylon ağ filtre kullanarak her bir tüpün hücre süspansiyonlarını filtreleyin.
not: Bu filtreleme adımı, ağ filtreden daha uzun/daha büyük kapları çıkarmak için önemlidir.
- Oda sıcaklığında WBB'de düz uçlu bir forseps veya sıyırıcı yardımıyla filtreyi kazıyarak kılcal damarları geri kazanın ve yeniden süspanse edin. Daha fazla kılcal damarı kurtarmak için süspansiyonu yeni bir filtreyle filtreleyin
- Süzüntüyü eşit olarak iki tüpe bölün ve 1.000 x g ve RT.
'da 7 dakika santrifüjleyin
NOT: Bu santrifüjleme adımı sırasında enzimatik çözeltiyi hazırlayın. Kullanılan hayvan sayısına göre gerekli WBB hacmini belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu). WBB'ye 1 adet DNaz 1 ve 1 adet Tosil-L-lisil-klorometan hidroklorür (TLCK) (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
- Adım 4.10'daki peletleri, enzimlerle önceden ısıtılmış WBB ile bir tüpte toplayın. Önceden ısıtılmış 1x kollajenaz / dispas ekleyin. Tüpü sallama masası su banyosuna 37 °C'de tam olarak 33 dakika yerleştirin.
- 30 mL soğuk WBB ekleyerek enzim reaksiyonunu durdurun. Süspansiyonu 1.000 x g'de 7 dakika santrifüjleyin ve RT'yi açın.
- Süpernatanı dikkatlice atın ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 6 yukarı ve aşağı vuruşla WBB'deki peleti ayırın. Bu adım daha az titiz ve nispeten daha hızlı olmalıdır.
- Süspansiyonu 1.000 x g ve RT.
'de 7 dakika santrifüjleyin
NOT: Bu adım sırasında, kaplamayı kültür kaplarından atın ve oda sıcaklığında DMEM ile bir kez durulayın. Hücre kültürü kaplarını RT'de en az 1 saat kaplayın.
- Adım 4.14'te elde edilen tüpten süpernatanı atın ve peleti yeni tam DMEM ortamında ayırın, hücreleri (Gün 0, P0) 6 oyuklu plakalardan oluşan 9 oyukta (her biri 9,6 cm2'lik 1 kuyucuk) kaplayın.
5. Serebral perisitlerin çoğalması
- Hücre kültürlerini steril bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de tutun. Hücreleri kapladıktan 24 saat (1. gün) sonra, kalıntıları dikkatlice çıkararak kültür ortamını değiştirin. 1. günden sonra, kültür ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
- Hücre kültürünü en az 7-8 gün gözlemleyin. Bu zamana kadar, endotelyal tek tabakanın üstündeki hücresel büyümeler gözlemlenebilir olmalıdır.
- Hücreleri 8-10. günde (birleşmeye bağlı olarak) perisit kültür ortamında jelatin kaplı kültür plakaları üzerindeki geçiş 1'e (P1) geçirin. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin. Hücreleri 6-7 gün boyunca gözlemleyin. Hücreler art arda tekrar bölünerek 17. günde 2. pasaj 2'ye (P2) [ve sadece gerekirse 24. günde pasaj 3 (P3)], jelatin kaplı plakalarda perisit ortamında büyütülür.
not: Hücreler yaklaşık %80-90 oranında birleşme hızında deney/gözlem için hazır olmalıdır.