$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
>1. Her numune için Enzim Karışımı 1 ve 2'yi hazırlayın
NOT: 2 mL'den büyük hacimler için 10 mL serolojik pipet kullanın; hacimler için 200 μL-2 mL, 1000 μL pipet kullanın; hacimler için, 21-199 μL, 200 μL pipet kullanın; 2-20 μL hacimler için 20 μL pipet kullanın; 2 μL'nin altındaki hacimler için 0-2 μL pipet kullanın.
- Her numune için, oda sıcaklığında Enzim P ve Enzim A'nın her birini bir alikot çözün.
- Enzim karışımı 1 için, 50 μL Enzim P ve 1900 μL Tampon Z'yi etiketli bir C Tüpünde (Malzeme Tablosu) birleştirin.
- Enzim karışımı 2 için, çözülmüş 10 μL'lik Enzim A'ya 20 μL Tampon Y ekleyin.
2. Yetişkin beyin ayrışma protokolü
>NOT: Numunelerle çalışırken, aksi belirtilmedikçe BSA ve D-PBS buz üzerinde kalırken tüpler oda sıcaklığında bir tüp rafına yerleştirilmelidir.
- Ayrıştırıcıyı açın.
- Hipokampi doku parçalarını C Tüpüne aktarmak için forseps kullanın.
- 30 μL Enzim karışımı 2'yi C Tüpüne aktarın. Kapağı gerginlik hissedilene kadar çevirin, ardından tık sesi gelene kadar sıkın.
- C Tüpünü baş aşağı ayrıştırıcının bir konumuna yerleştirin; numuneye Seçildi durumu atanacaktır (Şekil 1). Isıtıcıyı C Tüpünün üzerine sabitleyin.
- Klasör simgesine basın, Sık Kullanılanlar klasörünü seçin, 37C_ABDK_02 programına gidin ve seçin. Programı seçilen tüm C tüplerine uygulamak için Tamam'a tıklayın, ardından Başlat'a dokunun (Şekil 1).
- Numune başına bir adet 50 mL konik tüp etiketleyin.
- Her 50 mL konik tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 2 mL BSA tamponu ile ıslatın.
- Programın tamamlanmasının ardından, ısıtıcıyı ve C tüpünü ayırıcıdan çıkarın.
- Numuneye 4 mL BSA tamponu ekleyin ve karışımı 50 mL konik tüp üzerindeki hücre süzgecine uygulayın.
- C Tüpüne 10 mL D-PBS ekleyin, kapatın ve çözeltiyi hafifçe döndürün. 50 mL konik tüp üzerindeki hücre süzgecine uygulayın.
- Hücre süzgecini ve C Tüpünü atın. Süspansiyonu 300 x g'da 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı aspire edin ve atın.
3. Enkaz kaldırma
- Peleti 1550 μL soğuk D-PBS ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu etiketli 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- 450 μL soğuk Kalıntı Temizleme Solüsyonu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin (girdap yapmayın).
not: Enkaz Temizleme Çözümü, ticari Yetişkin Brian Ayrışma Kitinde bulunan bir reaktiftir.
- Hücre süspansiyonunun üzerine 1 mL soğuk D-PBS'yi nazikçe yerleştirin ve ucu konik tüpün duvarına karşı tutun. Toplam kaplama 2 mL.
olana kadar tekrarlayın
not: Bu adım kritiktir; Yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirin.
- Tam hızlanma ve tam fren ile 4°C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin.
not: Fazlar net bir şekilde ayrılmamışsa, 7.2-7.3 adımlarını tekrarlayın. 1000 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da son bir kez santrifüjleyin.
- Süspansiyon şimdi üç farklı katmandan oluşmalıdır (Şekil 2). En üstteki katmanı aspire edin. Beyaz orta tabakayı aspire etmek için pipet ucunu ileri geri süpürün. En alttaki katmanı bozmadan orta katmanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
not: Bu adım kritiktir; Yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirin.
- 2 mL soğuk D-PBS ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Tam hızlanma ve tam fren ile 10 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın. Peletleri 1 mL BSA tamponunda yeniden süspanse edin.
NOT: Hücreler uygun tamponda yeniden süspanse edilebilir, daha sonra bu noktada tek hücre dizilimi için hazırlık olarak manyetik olarak etiketlenebilir ve izole edilebilir.
