Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
>1. Beyin ve omurilik dokusunun tek hücreli süspansiyonlarının hazırlanması
- Beyin veya omurilik dokusunu besiyeri ile birlikte 100 mm'lik Petri kabının üst kısmına tüp ve dokuyu dökerek aktarın. Forseps kullanarak, dokuyu Petri kabının dibine taşıyın. Beyni veya omuriliği steril bir tıraş bıçağıyla ince bir şekilde kıyın. Jiletli bıçağı kullanarak, dokuyu toplamak için kıyılmış mendili kazıyarak plakanın dibine doğru hareket ettirin.
not: Aşağıdaki enzimatik sindirim protokolü için, işleme için en fazla iki omurilik bir araya getirilebilir. Beyinler kişiye özel olarak işlenmelidir.
- 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, Petri kabına 3 mL RPMI (Roswell Park Memorial Institute ortamı (% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş) ekleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, ortamdaki dokuyu yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
not: Alt uygulama tek hücreli veya toplu RNA dizileme analizi veya hücre kültürü ise, hücrelerin analizden önce aktive edilmediğinden emin olmak için FCS lotları test edilmelidir. Alternatif olarak, hücreler %10 FCS'li RPMI yerine %0,04 BSA'lı 1x PBS kullanılarak işlenebilir.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, artık dokuyu toplamak ve toplam 5 mL hacim için konik bir tüpe aktarmak için Petri kabını 2 mL ek bir ortamla yıkayın. İşlem adımları arasında tüpleri buz üzerinde tutun.
- Bir pipet kullanarak, istenen konsantrasyonu elde etmek için (ör., 100 mg / mL). İstenen nihai konsantrasyonu elde etmek için kıyma doku örneğini içeren konik tüpe kollajenaz tip I ekleyin (ör., 1 mg / mL için 50 μL).
not: Daha yüksek kollajenaz konsantrasyonları hücre verimini artıracaktır ancak hücre yüzeyi belirteçlerini parçalayabilir. Bu nedenle, kollajenaz I lotları, gerekli tüm hücre yüzey belirteçleri bozulmadan en yüksek sayıda canlı hücre elde etmek için gereken optimal konsantrasyonu belirlemek için titre edilmelidir. Örneğin, kollajenaz I, tek beyin veya omurilik örneklerinde 0.5 mg / mL, 1 mg / mL ve 2 mg / mL'lik nihai konsantrasyonlarda test edildi. Hücre canlılığı, tripan mavisi dışlama yöntemi kullanılarak belirlendi ve hücre yüzey belirteçleri CD45, CD19 ve CD4, akış sitometrisi ile değerlendirildi. 1 mg / mL kollajenaz I konsantrasyonu, ilgilenilen tüm hücre yüzeyi belirteçlerini korurken en yüksek canlı hücre sayısını verdi. Bu nedenle, bu konsantrasyon, bu hücre tiplerini inceleyen daha ileri deneyler için kullanıldı.
- DNaz I tozunu 0.15 M sodyum klorür kullanarak istenen stok konsantrasyonuna kadar nazikçe yeniden süspanse edin. 20 U/mL.
'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeniden süspanse edilmiş DNaz I'i kıyılmış doku örneğini içeren konik tüpe ekleyin
not: DNaz I lotları, mL başına aktivite birimlerine göre değişir. Doku örneğine eklenecek konsantrasyon, stok şişesinin mililitre başına aktivite birimlerine bağlı olarak değişecektir. Numune başına istenen nihai konsantrasyon 20 U/mL'dir.
- Tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda bir tüp rafına yerleştirin ve 40 dakika inkübe edin. Dokuyu enzimlerle iyice karıştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir ters çevirin. İnkübasyondan sonra, 0.01 M EDTA'lık bir son konsantrasyon için her tüpe 500 μL 0.1 M EDTA (pH = 7.2) ekleyin ve kollajenazı inaktive etmek için 5 dakika daha inkübe edin.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, her tüpün hacmini ~ 14.5 mL'ye getirmek için her tüpe% 10 FCS ile desteklenmiş 9 mL RPMI ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Vakumlu bir Pasteur pipeti kullanarak, hücre peletine dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin.
- 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre peletini içeren tüpe 3 mL %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, nihai hacmi 10 mL'ye getirmek için ek RPMI %10 FCS ortamı ekleyin ve %30'luk bir stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi katmanı oluşturmak için hücre peletini yeniden süspanse edin.
not: %100 stok izotonik yoğunluk gradyan ortamını önceden hazırlayın, alikot yapın ve 4 °C'de 3 aya kadar saklayın. %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisini hazırlamak için, yoğunluk gradyan ortamını (Malzeme Tablosu) yoğunluk gradyan medya seyreltme tamponu ile seyreltin. Yoğunluk gradyan ortam seyreltme tamponunu (80.0 g/L NaCl, 3.0 g/L KCl; 0.73 g/L Na2HPO4, 0.20 g/L KH2PO4; 20.0 g / L glikoz) hazırlayın ve bir vakum filtre sistemi kullanarak filtre sterilize edin. 1 kısım yoğunluk gradyan seyreltme tamponu ve 9 kısım yoğunluk gradyan ortamını karıştırarak %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisini yapın. İyice karıştırın.
- %70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi altlığını eklemeden önce her bir tüpü iyice ters çevirin ve karıştırın. Tüpün dibine 1 mL% 70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içeren 1 mL'lik bir serolojik pipet yerleştirin. Kabarcık yapmamaya dikkat ederek 1 mL çözeltinin 1 mL'sini yavaşça altına koyun. Gradyanı bozmamaya dikkat ederek serolojik pipeti tüpten yavaşça çıkarın.
not: %70 altlık için, %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi, RPMI ortamı kullanılarak %70'e seyreltilmelidir (yani, 7 mL %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ve 3 mL RPMI ortamı iyice karıştırılır). Ek olarak, miyelin kalıntılarının giderilmesi ve santrifüjlemeyi takiben gradyan arayüzünde saf tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi için temiz, bozulmamış %70'lik bir altlık oluşturmak çok önemlidir.
- Frensiz olarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Miyelin kalıntı tabakası da dahil olmak üzere süpernatanı, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek tüpte 2-3 mL kalana kadar aspire edin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak %30/70 yoğunluk gradyanı arasındaki hücre katmanını hasat edin ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, son hacmi 15 mL'ye getirmek için RPMI% 10 FCS ortamı ekleyin. 450 x g'yi 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin
not: Bu adım sırasında, gerekirse iki tüpten hücre katmanları bir araya getirilebilir. İkiden fazla tüpü bir araya getirmeyin, aksi takdirde yüksek yoğunluklu gradyan ortam konsantrasyonu nedeniyle hücreler topaklanmaz.
- Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice aspire edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için hücreleri uygun bir hacim / tamponda yeniden süspanse edin (örneğin, aşağı akış yüzey boyaması için 250 μL FACS tamponunda tek bir omuriliği yeniden süspanse edin) (Şekil 1).
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonlarını bir filtre üst tüpünün (Malzeme Tablosu) üstüne aktarın ve kalan miyelin kalıntılarını gidermek için hücrelerin tüpün altına kadar filtrelemesine izin verin.
- Tripan mavisi dışlama boyası kullanarak, seyreltin ve doğruluk için en az iki adet 16 karelik ızgaranın ortalamasını alarak bir hemositometredeki hücreleri sayın40,41.
- İstenen tek hücreli analiz tekniği ile devam edin.
not: Çeşitli kollajenaz formları (yani D, tip I, tip II, tip IV), bağışıklık hücreleri, mikroglia (Şekil 1), astrositler, perisitler, endotel hücreleri49 ve nöronlar50 kullanılarak verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonuçlar için elde edilen çekirdekli hücre sayımları, titre edilmiş kollajenaz I enzimi kullanılarak aşağıdaki gibidir: Tüm sahte tedavi edilmiş beyin = 500.000-600.000 hücre; Tüm TMEV-IDD beyni = 800.000–1.000.000 hücre; Tüm sahte tedavi edilmiş omurilik = 150.000-200.000 hücre; Tüm TMEV-IDD omuriliği = 300.000–400.000. Hücre sayımları, toplama, işleme ve CNS iltihabının mevcut olup olmadığına bağlı olarak değişecektir.
