Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yumuşak ışık lambasının hazırlanması (1. gün)
- A5 kağıt boyutunda 0,3-0,5 cm kalınlığında şeffaf bir akrilik levha kullanın. Akrilik plakanın önüne ve arkasına beyaz pedler yapıştırın.
- Işıkların akrilik plakanın yanından girebilmesi ve ardından paralel olarak dışarı çıkabilmesi için plakanın kenarına bir sıra LED beyaz ışık yerleştirin (Şekil 1A-F, Şekil 2B).
not: Erken evrede EB'lerin çapları yaklaşık 200 μm ila 300 μm olduğundan, temiz tezgahların floresan lambası altında çıplak gözle net bir şekilde gözlemlemek zordur. Buna karşılık, dağınık yansımanın artması nedeniyle, yanal aydınlatmalı yumuşak ışık kullanarak EB'leri net bir şekilde tespit edebiliriz (Şekil 2B, C). Sonraki deneylerde EB kültürleri için 6 oyuklu bir plaka önerilir. Ancak yumuşak ışığın görsel etkisini daha iyi göstermek için bu çalışmada fotoğraf ve video çekmek için bazen tabaklar yerine tabaklar kullanılıyor, bu yüzden lütfen yanlış anlaşılmasın. Yanal aydınlatmalı yumuşak ışık lambası, 6 oyuklu plaka için de kullanılabilir.
2. EB transferi ve orta replasman (2-5. gün)
- Yeni bir 6 oyuklu düşük yapışma plakası hazırlayın ve her oyuğa 2 mL embriyoid cisim (EB) oluşum ortamı ekleyin.
- EB'leri ortamla birlikte 1000 μL geniş delikli pipet ucuyla çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın) ve bunları 6 oyuklu düşük yapışma plakasına (~100 EBs/kuyucuk) aktarın.
not: Çalışma süreci, EB'lerin gözlemlenmesini kolaylaştırmak için yumuşak bir ışık lambası (1. adımda bahsedilmiştir) kullanır. Yumuşak ışığın görsel etkisini iyileştirmek için diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın.
- Her gün aynı hacimde taze EB oluşum ortamı ile değiştirin. EB'leri merkeze toplamak ve ortamı değiştirmek için ikincil akışı kullanın.
- Kuyunun kenarına yavaşça pipetleyerek eski ortamı aspire edin. Çok sert emmeyin; aksi takdirde, EB'ler birlikte kaldırılacaktır. Ardından, EBs.
yeniden askıya almak için taze ortam ekleyin
not: İkincil akış prensibi (Şekil 2D). Çanağı dairesel bir yörünge boyunca döndürerek bir girdap akışı indükleyin. Girdap akışı nedeniyle, ikincil bir akış indüklenir ve merkeze doğru yönlendirilir. EB'ler veya organoidler, dönme yoluyla üretilen ikincil akış nedeniyle kuyunun merkezine yakınsar, daha sonra ortam değişimi veya embriyoid transferi kolayca gerçekleştirilebilir.
>3. Nöral indüksiyon (5-7. gün)
- Düşük yapışma özelliğine sahip yeni bir 6 oyuklu plaka hazırlayın ve her oyuğa 3 mL Nöral indüksiyon ortamı (Tablo 1) ekleyin.
- Yanal yumuşak ışığı açın (1. adımda bahsedilmiştir) ve diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın.
- EB'leri, eklenen Nöral indüksiyon ortamı (~ 100 EB / kuyu) ile 6 oyuklu plakaya aktarın. Yeni kuyuya orijinal ortamdan mümkün olduğunca az ekleyin.
not: Organoid transferinin basit becerilerini tanıtın. Doğal olarak, yerçekimi altında ve ortamdan nispeten daha yüksek bir yoğunluğa sahip olan yeniden süspanse EB'ler, Şekil 2E'de gösterilen işlemi uygulayarak yavaş yavaş batacaktır. Bu nedenle, EB'ler uygun bir şekilde aktarılabilir. EB'lerle karşılaştırıldığında, serbest hücreler ve ölü hücre parçaları daha yavaş battığından, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu bu çökeltme yöntemiyle uzaklaştırılabilir (Şekil 2F).
- Numuneleri 37 °C ve %5CO2'de 24 h.
için inkübe edin
not: Mikroskop altında, EB'lerin çapı yaklaşık 500 μm idi ve kenar yarı saydamdı, bu da bir nöroepitelyal tabakanın oluştuğunu gösteriyordu.
Tablo 1. Nöral indüksiyon ortamının bileşimi
Serisi
| Bileşen | hacim |
| DMEM-F12 | 97 mL |
| N2 takviyesi | 1 mL |
| Glutamax takviyesi | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| Heparin | Son konsantrasyon 1 μg/mL |
