1. Kültür ortamı ve araç hazırlama
- Tezgah ve çalışma alanına %70 etanol püskürtün ve kurumaya bırakın.
- Diseksiyon aletlerine, forsepslere ve iki cam saat kabına %70 etanol püskürtün ve tezgahta kurumaya bırakın.
- Takviye edilmiş Schneider ortamını (SSM, Tablo 1) yapın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Cam saat tabaklarının her birine 1 mL SSM pipetleyin.
- Steril uçlu bir mikropipet kullanarak, yumurtadan yeni çıkmış larvaları PBS plakasından ilk cam saat çanağındaki SSM'ye aktarın. Steril uçlu bir mikropipet kullanarak, yumurtadan yeni çıkmış larvaları ikinci cam saat çanağındaki SSM'ye aktarın.
2. Diseksiyonlar ve beyin kültürleri
- Larvalar SSM'li ikinci cam saat çanağına girdikten sonra, forseps ve diseksiyon mikroskobu kullanarak larvaların beyinlerini inceleyin. Büyütmeyi gerektiği gibi ayarlayın.
- Ağız kancalarını tutmak için bir forseps kullanın ve diğeriyle vücudu nazikçe yarıya kadar tutun ve larvaları iki parçaya bölmek için ters yönde çekin (Şekil 1).
not: Beyin, ağız kancalarının hemen arkasında yer alacaktır. Beyni çevreleyen başka dokular olabileceğini unutmayın. Beyne zarar verebileceği için bu dokuları çıkarırken çok dikkatli olun.
- 15-20 beyin diseke edildikten sonra, steril 12 oyuklu bir kültür tepsisinin bir oyuğuna 1 mL SSM ekleyin. Yeni diseke edilmiş beyinleri bir mikropipet ve steril bir uç kullanarak SSM'ye aktarın (Şekil 2A).
- Beyinleri 12 oyuklu kültür tepsisindeki SSM ortamına 24 saat boyunca 25 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 2A).
Tablo 1: Takviyeli Schneider ortamı (SSM) yapmak için tarif. Tablo, 5 mL SSM hazırlamak için gereken tüm bileşenlerin hacmini listeler.
| Bileşen (başlangıç konsantrasyonu) | 5 mL yapmak için | Son konsantrasyon |
| Schneider'in Drosophila medyası | 3,89 mL | |
| Fetal sığır Serumu (%100) | 500 μL< | %10 |
| Glutamin (200 mM) | 500 μL | 20 milyon |
| Penisilin (5000 ünite/mL), Streptomisin (50.000 μg/mL) | 100 μL | 1000 U/mL Kalem, 1 mg/mL Strep |
| İnsülin (10 mg/mL) | 10 μL | 0.02 mg / mL |
| glutatyon (50 mg / mL) | 5 μL | 0.05 mg / mL |
| Steril bir başlıkta, steril teknik kullanarak, tüm malzemeleri 14 mL'lik konik bir tüpte bir araya getirin. Kullanana kadar buzun üzerine koyun. |
