$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare Beyin Korteks Ayrışması
- Doğum sonrası 5-7 günlük C57Bl/6N fare yavrularını, daha önce %70 etanol içinde temizlenmiş makasla hızlı bir şekilde kafa kesme yoluyla kurban edin.
not: Her preparat için 5-6 yenidoğan fare yavrusundan alınan serebral korteksler kullanıldı. Ortalama olarak, bir fare beyni 1-1.5 x 106 primer oligodendrosit (Ols) verir.
- Kafa derisi derisini orta hat boyunca küçük diseksiyon makasıyla kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için geri çekin.
- Beyne zarar vermemek için kafatasını kafatasının arkasındaki açıklıktan başlayarak ön bölgeye doğru orta hat boyunca dikkatlice kesin, makasla yukarı kaldırın. Daha sonra, kafatasının arkasındaki açıklığı kullanarak, kafatasının tabanı boyunca her bir göz yuvasına doğru kesin.
- Korteksleri orta beyinden nazikçe uzaklaştırmak için ince forseps kullanın ve bunları 7 mL B27NBMA içeren 60 mm'lik bir doku kültürü kabına aktarın. Her beyin için 2.2'den 2.4'e kadar olan adımları tekrarlayın ve diseke korteksleri bir araya getirin.
- Korteksleri 5 mL ayrışma tamponu (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain ve 2.500 U DNaz I) içeren 60 mm'lik yeni bir doku kültürü kabına aktarın.
- #15 neşter bıçağı kullanarak korteksleri yaklaşık 1 mm'lik3'lük küçük parçalar halinde doğrayın ve 37 °C,% 5 karbondioksit (CO2) inkübatörde 20 dakika inkübe edin.
- Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 1 mL sığır büyüme serumu (BGS) ekleyin.
- Korteksleri ayrışma ortamı ile birlikte 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Kabarcıkları en aza indirmek için dikkatli davranarak, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 6-8 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek beyin dokusunu nazikçe ayırmaya başlayın.
- Doku parçalarının 2-3 dakika oturmasına izin verin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
- Doku peletine %10 BGS/2500 U DNaz I içeren 3 mL B27NBMA ekleyin.
- 6-8 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparken beyin dokusunu nazikçe ayırmak için 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanın. Kabarcıkları en aza indirmeye dikkat edin.
- Doku parçalarının 2-3 dakika oturmasına izin verin.
- Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Doku peletine %10 BGS/DNaz I içeren 3 mL B27NBMA ekleyin.
- Bir P1000 pipet ucu kullanarak beyin dokusunu nazikçe ayırın, aynı zamanda ortam ve beyin dokusu karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin. Hangisi önce gelirse, büyük doku parçaları kalmayana veya %10 BGS/DNaz I içeren B27NBMA bitene kadar Adım 2.13 ve 2.14'ü tekrarlayın. Kabarcıkları en aza indirmeye dikkat edin.
- Önceki süpernatantlarla havuz hücresi süspansiyonu.
- 70 μm hücre süzgecini 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, havuzlanmış hücre süspansiyonunu 70 μm'lik hücre süzgecinin üzerinden nazikçe geçirin.
- Hücre süzgecini %10 BGS/DNaz I içeren 1 mL B27NBMA ekleyerek yıkayın.
- Hücre süzgecini atın. % 10 BGS / DNase I içeren B27NBMA ile hacmi 30 mL'ye getirin.
- Hücre süspansiyonunu iki adet 15 mL'lik konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Hücreleri havaya maruz bırakmadan süpernatanı çıkarın. Süpernatant, hücre kalıntıları nedeniyle bulanık olacaktır. Pelete %10 BGS içeren 3 mL B27NBMA ekleyin.
- Bir P1000 pipeti kullanarak hücre peletini dikkatlice ayırın. % 10 KŞ içeren B27NBMA ile hacmi 15 mL'ye getirin.
- Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik yeni bir hücre süzgecinden geçirin.
- %10 KŞ içeren 1 mL B27NBMA ekleyerek hücre süzgecini yıkayın. Hücre süzgecini atın.
- % 10 KŞ içeren B27NBMA ile hacmi 30 mL'ye getirin.
- Hücre süspansiyonunu 2 x 15 mL konik tüplere aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Hücreleri havaya maruz bırakmadan süpernatantın çoğunu çıkarın. Hücre peletlerini 5 mL buz gibi soğuk manyetik hücre sıralama (MCS) tamponunda yeniden süspanse edin.
2. Hücre Sayısı ve Canlılığının Belirlenmesi
- % 0.4 (a / h) oranında 1: 5 seyreltme elde etmek için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL hücre süspansiyonunu 400 μL Tripan Mavi Çözeltisi ile seyreltin.
- Bir kapak camını bir hemositometre odasının üzerine ortalayın ve iki odayı bir P10 pipeti kullanarak ve aşırı doldurmayı önleyerek 10 μL hücre seyreltmesi ile doldurun. Çözelti, kılcal hareket ile kapak camının altından geçecektir.
- Hemositometreyi mikroskop tablasına yerleştirin ve 40X büyütme kullanarak odağı ayarlayın.
NOT: Hücre sayımları, beş karenin her birinde (dört köşe ve bir merkez) elde tutulan bir sayaç kullanılarak kaydedilir. Sadece cansız hücreler boyayı emer ve mavi görünürken, canlı ve sağlıklı hücreler yuvarlak ve kırıcı görünür ve mavi renkli boyayı emmez, bu da mililitre başına canlı ve toplam hücre sayısının belirlenmesine izin verir.
3. O4+ Oligodendrositlerin İzolasyonu
- Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Hücrelerin havaya maruz kalmasını önleyerek vakum aspirasyonu kullanarak süpernatanı dikkatlice atın.
- Peletleri 1 x 107 toplam hücre başına 90 μL MCS tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 1 x 107 hücre başına 10 μL anti-O4 boncuk ilave edin.
- 15 mL'lik konik tüpü parmağınızla 4-5 kez hafifçe vurarak hücre süspansiyonunu ve boncukları karıştırın.
- Karışımı 4 °C'de 15 dakika inkübe edin, 15 mL konik tüpü parmağınızla her 5 dakikada bir 4-5 kez hafifçe vurun.
- Tüpüne 1 x 107 hücre başına 2 mL MCS tamponu ekleyerek karışımı yıkayın. Karışımı 200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Hücrelerin havaya maruz kalmasını önleyerek, vakum aspirasyonunu dikkatlice kullanarak süpernatanı atın. Hücre peletini her 1 x 107 hücre için 500 μL MCS tamponunda yeniden süspanse edin.
- Manyetik ayırıcı standına manyetik bir ayırıcı takın. Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu takın ve sütunun üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için ayırma kolonunun altına iki adet 15 mL veya bir adet 50 mL konik tüp yerleştirin.
- 40 μm'lik hücre süzgecini ve ayırma kolonunu 3 mL MCS tamponu ile önceden durulayın ve tamponun kurumasına izin vermeden kolondan geçmesine izin verin.
- Hücre süspansiyonu ve boncuk karışımını hücre süzgecine ve seçim sütununa ekleyin.
- 40 μm hücre süzgecini 1 mL MCS tamponu ile yıkayın.
- Hücre süzgecini atın ve hücre, boncuk ve tampon karışımının kurumasına izin vermeden kolondan geçmesine izin verin.
- Ayırma kolonunu 3 kez 3 mL MCS tamponu ile ve 1 kez OL proliferasyon ortamı ile yıkayın.
- Ayırma kolonunu manyetik ayırıcıdan çıkarın, hızlı bir şekilde 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve hemen 5 mL OL proliferasyon ortamı ekleyin.
- Kolonun üstüne bir piston yerleştirin ve etiketli hücreleri 15 mL konik tüpe boşaltmak için sıkıca itin.
- Bölüm 3.
'de belirtildiği gibi Tripan Mavisi ve hemositometre kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için 100 μL hücre süspansiyonunu çıkarın
NOT: %80'in üzerindeki hücre canlılığı, OL kültürüne devam etmek için kabul edilebilir olarak kabul edilir, ancak %90'dan büyük canlılık optimaldir.