Yöntem makalesi

Schwann Hücre Fenotiplerini İncelemek için Mikrodesenli Bir Substratın Hazırlanması

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Xu, Z., Orkwis, et al. Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek için Ayarlanabilir Hücre Dışı Matriks Mikro Ortamlarının Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2020).

Video, hücre fenotip spesifikasyonunu incelemek için mikro desenli bir substratın hazırlanmasını açıklar. Mikro deseni PDMS kaplı bir lamel üzerine aktarmak için protein kaplı mikro desenli bir PDMS damgası kullanılır. Lamel daha sonra istenmeyen yüzeylerde hücre yapışmasını engellemek için bir yüzey aktif madde ile muamele edilir. Hücreler daha sonra desene yerleşmek için eklenir ve daha fazla analiz için inkübe edilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ayarlanabilir hücre kültürü substratı hazırlama ve karakterizasyonu

  1. Yüzey hazırlığı
    1. Polidimetilsiloksan (PDMS) baz elastomerini ve sertleştirici maddeleri, kabarcıklar karışım içinde homojen bir şekilde dağılana kadar 10:1 ile 60:1 arasında bir oranda bir pipet ucu kullanarak kuvvetlice karıştırın. Kabarcıklar dağılana kadar vakumla kurutma kullanarak kabarcıkları çıkarın.
      NOT: PDMS polimerizasyonu sırasında, kürleme maddesi, nihai polimerin istenen mekanik özelliklerini sağlamak için baz elastomer ile çapraz bağlanır. Çapraz bağ oranları, PDMS sertliğini değiştirmek için ayarlanabilir.
    2. Kare veya dairesel bir lamel (örn. 22 mm x 22 mm) üzerine bir damla (~ 0,2 mL) kurutulmuş PDMS karışımı yerleştirin ve lamel bir spin kaplayıcı üzerinde 2500 sn boyunca 30 rpm'de döndürün.
    3. Lameli 60 °C'de bir fırında 1-2 saat veya PDMS'nin katılaşması için gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. Yüzey hidrofilikliğini artırmak için lameli UV-Ozon temizleyici kullanarak 7 dakika (UV dalga boyu: 185 nm ve 254 nm) uygulayın. Sterilize edilmiş 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin.
    5. Hücre kültürü için kullanmadan önce, substratları en az 30 dakika boyunca %70 etanol içinde inkübe edin.
      DİKKAT: UV-Ozon temizleyici, insanlar için zararlı Ozon üretebilir. Kimyasal davlumbazda veya bir tür havalandırma ile çalışın.
  2. Mikro desenli substrat hazırlama
    1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak istenen geometriyi ve hücre yapışkan alanlarını (900 μm2, 1.600 μm2 ve 2.500 μm2) çizin. Ticari bir tedarikçiden bu desenlere dayalı bir krom fotoğraf maskesi oluşturun.
    2. Temiz bir odada veya tozsuz bir ortamda, silikon gofretler üretmek için standart fotolitografi tekniklerini kullanın. Bu özel uygulama için kritik parametreler aşağıdaki gibidir: Fotorezist: SU-8 2010; Fotorezisti dağıtmak için sıkma profili: 100 rpm/s hızlanma ile 10 s için 500 rpm, ardından 300 rpm/s hızlanma ile 30 s için 3500 rpm; UV ışığının maruz kalma enerjisi: 130 mJ / cm2.
      NOT: Silikon gofretler üzerindeki desenlerin yüksekliği, bu parametrelere göre yaklaşık 10 μm'dir. Dikdörtgen veya üçgen desenlerin dışındaki kenarlardaki potansiyel çatlaklar, adım 1.2.2'den sonra bir ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Silikon gofretin 190 °C'de 30 dakika pişirilmesi çatlakların giderilmesine yardımcı olur.
    3. Desenli silikon gofreti 150 mm çap x 15 mm yüksekliğinde dairesel bir Petri kabının içine yerleştirin ve adım 1.1.1'de hazırlandığı gibi gazı alınmış PDMS'yi (karışım oranı 10:1) silikon gofret üzerine dökün.
      NOT: Mikro temaslı yazdırma adımları sırasında kullanım kolaylığı için PDMS'nin kalınlığının en az 5 mm olduğundan emin olun.
    4. PDMS'yi bir silikon gofret üzerinde gece boyunca 60 °C'de bir fırında katılaştırın. PDMS'nin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Cerrahi bir neşter kullanarak silikon gofretten doğru desenleri içeren 30 mm x 30 mm kare pulları hassas bir şekilde kesin. Silikon gofrete zarar vermeyin.
      NOT: Silikon gofretler, izopropanol ile temizlendikten sonra daha fazla damga üretmek için bu noktada birçok kez yeniden kullanılabilir.
    5. PDMS damgalarını ve ayarlanabilir lamel lerini (1.1.1 ila 1.1.3 adımlarında hazırlanır) 30 dakika boyunca %70 etanole daldırarak sterilize edin.
    6. Mikro temaslı baskıdan sonra PDMS damgaları ile mikro desenin etkinliğini doğrulamak için, PDMS damgalarının yüzeyini filtrelenmiş bir hava akımı kullanarak kurutun ve PDMS damgasının tüm desenli tarafını kaplayacak şekilde 50 μg / mL Sığır serum albümini (BSA) (Texas Red konjuge) solüsyonu pipetleyin.
    7. Protein adsorpsiyonuna izin vermek için PDMS damgalarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca BSA çözeltisi ile inkübe edin.
    8. Ayarlanabilir lamellerin yüzeyini filtrelenmiş bir hava akımı kullanarak kurutun ve adım 1.1.5'te açıklandığı gibi yüzey hidrofilikliğini artırın.
    9. Kalan BSA solüsyonunu çıkarmak için PDMS damgalarını havayla kurutun.
      NOT: BSA solüsyonunun damgadan tamamen çıkarılmış olmasına dikkat edin, çünkü kalan herhangi bir solüsyon mikrokontaklı yazdırma sırasında pulların lamel üzerinde kaymasına neden olacaktır.
    10. Lamel yüzeyinde BSA adsorpsiyonu için damganın desenli tarafını ayarlanabilir lamel ile uyumlu temasa getirin. Damgayı lamel üzerine 5 dk.
      boyunca hafifçe bastırın NOT: Damga büküleceği ve damga ile lamel arasında spesifik olmayan temasa neden olacağı için damga üzerine aşırı kuvvet uygulamayın. Damgaya uygulanan uygun miktarda kuvvet, başarılı bir mikro temaslı baskı için çok önemlidir.
    11. FITC (Floresein izotiyosiyanat) filtreli bir floresan mikroskobu kullanarak mikro modeli inceleyin.
    12. Floresan desenler yerine hücre yapışkan alanlarını yazdırmak için, BSA proteini yerine laminin kullanın ve 1.2.5 ila 1.2.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
    13. Lamellerden pulları çıkarın ve lamelleri sterilize edilmiş 6 oyuklu bir plakaya aktarın. Lamelin yüzeyini kaplamak için her bir oyuğa 2 mL w/v %0.2 Pluronic F-127 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      NOT: Pluronic F-127, hücrelerin yapışmasını engellemek için PDMS yüzeyinin hidrofobikliğini artırarak PDMS yüzeyine adsorbe edilebilir.
    14. Pluronic F-127 çözeltisini aspire edin ve hücreleri tohumlamadan önce 5x'i Fosfat tampon salin (PBS) ile ve 1x'i hücre kültürü ortamı ile yıkayın. SC'ler için tipik bir tohumlama yoğunluğu 1.000 hücre/cm2'dir.
    15. Hücre tohumlamasından 45 dakika sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve birden fazla SC'nin aynı desene yapışmasını önlemek için lamelleri PBS 2x ile yıkayın. Hücreleri, nicelemeden önce 48 saat boyunca istenen hücre kültürü ortamında tutun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serumu (BSA) albümini, Texas Red konjugatıThermo Fisher BilimselA23017Mikro desenleri göstermek için BSA boyama
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal OrtamıThermo Fisher Bilimsel11965092Hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Bilimsel16000044Hücre kültürü ortamı takviyesi
FibronektinThermo Fisher Bilimsel33010-018Lamelleri kaplamak için kullanılan protein
Floresan mikroskobuNikonTutulma Ti2Floresan mikroskobu
LamininThermo Fisher Bilimsel23017015Lamelleri kaplamak için kullanılan protein
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Bilimsel15140122Hücre kültürü ortamı takviyesi
Plüronik F-127Sigma AldrichP-2443 SerisiSpesifik olmayan protein bağlanmasını bloke edin
SYLGARD 184 PDMS baz ve kürleme maddesiSigma Aldrich761036Lamelleri kaplamak için kullanılan ayarlanabilir polimer
UV-Ozon temizleyiciNova taramasıPDMS'nin hidrofisilitesini artırın
Serisi · ·

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Schwann H creleriPDMS DamgaProtein KaplamaY zey lemiH cre AdezyonuFloresan MikroskobuPluronic F127PBS ile Y kamaK lt r nk basyonu

İlgili makaleler