Schwann Hücrelerinin Fare Omurga Köklerinden İzolasyonu

Özet

Kaynak: He, Q., et al., & Ding, F. Fibroblastların ve schwann hücrelerinin in vitro olarak duyusal ve motor sinirlerden saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, fare omurga köklerinden Schwann hücrelerinin izolasyonunu ve kültürlenmesini özetlemektedir. İzole edilen hücreler daha sonra spesifik ortamda kültürlenir. Schwann hücreleri, diferansiyel sindirim ve aderans yoluyla izole edilir. Daha sonra bağlanma ve çoğalma için hücre dışı matris kaplı lamellere aktarılırlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Motor ve duyusal sinir fibroblastlarının ve SC'nin (Schwann hücreleri) izolasyonu ve kültürü

1. Çin Nantong Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden yedi günlük Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (n = 4) kullanın. Sıçanları 2-3 dakika boyunca% 5 izofluran içeren bir tanka koyun, hayvanların yavaş nefes almasına ve bağımsız bir aktiviteye sahip olmamasına izin verin ve ardından dekapitasyondan önce% 75 etanol kullanarak sterilize edin.
2. Sırt derisini yaklaşık 3 cm kesmek için makas kullanın ve omurgayı çıkarın. Omuriliği ortaya çıkarmak için omur kanalını dikkatlice açın.
3. Omuriliği 2-3 mL buz gibi soğuk D-Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile 60 mm'lik bir Petri kabında tutun.
4. Anatomik yapıya bağlı olarak, ventral kökü (motor sinir) ve ardından dorsal kökü (duyusal sinir) diseksiyon mikroskobu altında çıkarın. Ardından, buz gibi bir D-Hanks'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) yerleştirin.
5. HBSS'yi çıkardıktan sonra, sinirleri makasla 3-5 mm'lik parçalar halinde dilimleyin ve 18-20 dakika boyunca 37 ° C'de 1 mL% 0.25 (a / h) tripsin ile sindirin. Daha sonra, sindirimi durdurmak için% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3-4 mL DMEM ile takviye edin.
6. Karışımı yaklaşık on kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, süpernatanı atın ve çökeltiyi% 10 FBS ile desteklenmiş 2-3 mL DMEM'de askıya alın.
7. 400 gözenekli bir filtre kullanarak hücre süspansiyonunu süzün, ardından hücreleri 60 mm'lik bir Petri kabına aşılayın ve 37 °C'de %5 CO2 içinde kültürleyin. 4-5 günlük kültürlemeden sonra,% 90 birleşmeye ulaştıktan sonra pasaj 0 (p0) fibroblastları ve SK'leri izole edin.
8. SK'lerin izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)
   1. Hücreleri 1x PBS kullanarak bir kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 8-10 saniye sindirmek için 60 mm Petri kabına 1 mL %0.25 (a/h) tripsin (37 °C) ekleyin. Bundan sonra, sindirimi durdurmak için% 10 FBS ile desteklenmiş 3 mL DMEM eklendi.
   2. SC'leri ayırmak için karışımı bir pipetle hafifçe üfleyin. Ardından, SC'leri 5 dakika boyunca 800 x g'da toplayın ve santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı atın ve kalıntıyı %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin, 2 μM forskolin ve 10 ng/mL HRG ile 3 mL DMEM'de süspanse edin ve ardından hücreleri kaplanmamış 60 mm'lik bir Petri kabına aşılayın. 37 ° C'de 30-45 dakika kültürlendikten sonra, fibroblastlar (birkaç fibroblast SC'lerle sindirilir) tabağın dibine yapışır.
   4. Süpernatanı (SC'ler dahil) başka bir poli-L-lizin (PLL) kaplı orta tabağa aktarın ve 2 gün boyunca 37 ° C'de kültürleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Duyusal ve motor Fibroblastların ve SK'lerin ayırma ve saflaştırma adımlarını gösteren şematik diyagram.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
D-Hank'in dengeli tuz çözeltisi	Gibco (Gibco)	14170112
DMEM (Ömer Çiçeğ	Corning	10-013-Özgeçmiş
Diseksiyon mikroskobu	Olympus	SZ2-ILST
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco (Gibco)	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
% 0.25 (a / h) tripsin	Gibco (Gibco)	25200-072
Kültür yemekleri
Santrifüj tüpleri
Lameller
Poli-L-Lizin
CO2 inkübatörü

Serisi