$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Geçirgen Destek Eklerinde Fare Endotel Kültürünün Hazırlanması
>NOT: BEND3 hücrelerinin bakımı üreticinin talimatlarına göre yapılır.
- 500 mL DMEM'e 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptomisin ekleyerek BEND3 hücre ortamını (BM) hazırlayın ve iyice karıştırın.
- Ortamı çanaktan aspire edin ve BEND3 hücre kültürünü 1 mL PBS ile bir kez yıkayın. Hücrelere 1 mL %0.25 tripsin-EDTA (etilen diamin tetraasetik asit) ekleyin ve 37 °C'de 4 dakika inkübe edin.
- Tripsin-EDTA'yı nötralize etmek için hücrelere 1 mL BM ekleyin ve hücreleri tamamen ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 400 x g'da 5 dakika santrifüjleme yoluyla peletleyin.
- Süpernatanı tüpten aspire edin ve hücreleri 9 mL taze BM ile yeniden süspanse edin, ardından bir geçirgen destek ekine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Matrisin alt haznesindeki oyuk başına 2 mL daha taze BM ekleyin. Hücreleri bir gün boyunca kültürlemeye devam edin.
2. Nöral-endotelyal Ko-kültür ve Ac4ManNAz Etiketleme Sisteminin Kurulması
- Bir gün, BEND3 hücrelerini uçlara yerleştirdikten sonra, önce alt haznedeki ortamı, ardından ekleri nazikçe aspire edin. Eklerin yüzeyini önceden ısıtılmış DMEM (Dulbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı) ile 3 kez yıkayın. Eklerin dış yüzeyini önceden ısıtılmış DMEM ile durulayarak yıkayın.
- Bir kesici parçaya 1 mL önceden ısıtılmış (yapışkan ortam) ekleyin, ardından ekleri birincil kortikal hücrelerle kuyucuklara aktarın. Ko-kültürü 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 12 saat inkübe edin.
- 200 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için Ac4ManNAz'i DMSO (dimetil sülfoksit) içinde çözün. Nöral-endotelyal ko-kültürü kurduktan 12 saat sonra, alt bölme başına 1 μL Ac4ManNAz stoğu ve ko-kültüre ek parça başına 0,5 μL stok ekleyin. Ortamı iyice karıştırmak için plakaları hemen ve hafifçe çalkalayın. Kontrol hücreleri için eşit hacimde DMSO ekleyin.
- Hücreleri 5 gün daha 37 ° C ve% 5 CO2'de kültürleyin. 'yi yeniden besleme ortamı (RM) olarak 10x bFGF ile hazırlayın. Bu süre zarfında, endotel ve nöral hücreleri her gün yeniden beslemek için kesici uç başına 100 μL RM ve alt bölme başına 200 μL RM ekleyin. Yeniden besleme sırasında kültüre Ac4ManNAz veya DMSO vermeyin.