Fare Parankimal Arteriyollerinden Serebral Endotel Tüplerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Hakim, M. A., et al., Fare Beyin Parankiminin Arteriolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, endotel tüplerini fare serebral parankiminden izole etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Enzimatik sindirim ve mekanik ayrışmanın bir kombinasyonu yoluyla, işlem endotel hücrelerine sahip sağlam bir tüp verir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Solüsyonlar ve ilaçlar

1. Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)
   1. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 10 mM glikoz kullanarak en az 1 L PSS hazırlayın.
   2. Serebral arteriyollerin diseksiyonu ve endotel tüpünün izolasyonu için CaCl₂ (sıfır Ca^{2 +} PSS) içermeyen gerekli solüsyonları hazırlayın.
      not: Tüm çözeltileri ultra saf deiyonize H2O içinde hazırlayın, ardından filtrasyon (0.22 μm) yapın. Nihai ürünün 290 ila 300 mOsm arasında ozmolaliteye sahip bir pH 7.4 içerdiğinden emin olun.
2. Sığır serum albümini (BSA,% 10)
   1. 1 g liyofilize BSA tozunu 10 mL sıfır Ca^{2 +} PSS'lik bir beherde çözün. Beheri kapatın ve BSA'nın çözülmesi için yavaşça karıştırarak en az 2 saat bekleyin.
   2. 10 mL'lik bir şırınga artı 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve -20 ° C'de saklanacak 1 mL alikotlar hazırlayın.
3. Diseksiyon çözümü
   1. Toplam 50 mL hacim için 49.5 mL sıfır Ca²⁺ PSS'ye 500 μL BSA (% 10) ekleyin.
   2. Çözeltiyi arteriolar diseksiyonlar için bir Petri kabına aktarın.
4. Ayrışma çözümü
   1. Toplam 50 mL hacim için 5 μL CaCl₂ çözeltisi (1 M) ve 500 μL BSA (% 10) ila 49.5 mL sıfır Ca^{2 +} PSS ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
5. Enzim
   1. 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditioeritritol, 250 μg / mL kollajenaz (Tip H karışımı) ve 40 μg / mL elastaz ile 1 mL sindirim çözeltisi hazırlayın.
      not: Enzim aktiviteleri değişebilir, ancak başarılı protokoller muhtemelen aşağıdaki enzimatik aktiviteleri gerektirecektir: papain için ≥ 10 birim / mg, kollajenaz için ≥ 1 birim / mg ve elastaz için ≥ 5 birim / mg.
       

2. Parankimal arteriyollerin izolasyonu

>NOT: Bu protokol için orta serebral arterlerden (MCA'lar) kaynaklanan ve beyin parankimine gömülü arteriyoller seçilmiştir. Arteriyoller daha önce tarif edildiği gibi izole edilir11, modifikasyonla.

1. İzole edilmiş beyni, odun kömürü ile aşılanmış silikon polimer kaplama (derinlik 50 cm) içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon solüsyonunda sabitlemek için çelik pimler (çap: 0,2 mm, uzunluk: 11 ila 12 mm) ≥ kullanın.
2. Keskin ve hizalı diseksiyon makası kullanarak, doku segmentinin üst kısmının Willis Çemberi'nden dallanma noktasını geçtiğinden emin olurken, MCA'nın etrafında bir dikdörtgen beyin dokusu (uzunluk: 5 mm, genişlik: 3 mm) (Şekil 1B) kesin. Gerekirse daha fazla arteriole erişmek için beynin diğer yarım küresinden başka bir dikdörtgen beyin dokusu kesin.
3. Ayrılmış beyin dokusu segmentini, çelik pimler (çap: 0,1 mm, uzunluk: 13 ila 14 mm) kullanarak MCA yukarı bakacak şekilde (Willis Çemberi'nin distalinde) tabağa sabitleyin. Pia'yı küçük forsepslerle çıkarmak için pimlerin yakınında dikkatlice sığ bir kesi yapın ve bir uçtan diğer uca doğru hafifçe soyun (Şekil 1C). Gerekirse daha fazla arteriole erişmek için pia'yı diğer doku segmentinden çıkarın. İzole edilmiş pia'yı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriyollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriyolleri diseksiyon yapın (Şekil 1D), arteriyollerin hasar görmediğinden emin olun.
   not: Arteriyoller parankimden pia ile kolayca çıkarılamıyorsa, ince forseps kullanın ve Willis Çemberi'nden MCA dal noktasından başlayarak beyni kazın. Arteriyolün yerini belirleyin, arteriyollerin etrafındaki dokuyu dikkatlice gevşetin (Şekil 1E) ve arteriyolün üst ucunu tutarak arteriole parankimden nazikçe çekin (Şekil 1F). Çoklu arteriyoller (uzunluk: ~ 1.5-2 mm) bir dikdörtgen beyin dokusundan izole edilebilir.
4. Arteriyolün temiz olduğundan ve ona bağlı doku olmadığından emin olun ve kalan distal dalları kesin (Şekil 2A). Enzimatik sindirim için bu temiz, sağlam arteriyol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüplerinin hazırlanması için enzimatik sindirim için her bir arteriole iki parçaya (uzunluk: 0.75-1 mm) kesin.
    

3. Parankimal arteriyollerin sindirimi ve endotel tüplerinin hazırlanması

1. Ekipman ve pipetlerin düzenlenmesi
   not: Arteriyel endotel tüplerinin beyinden izolasyonu daha önce tarif edilmiştir13,18. Mevcut protokol, endotelin parankimal (intraserebral) arteriyollerden izolasyonu için modifikasyonlar içermektedir. Enzimatik sindirim için birden fazla arteriol ve/veya arteriol parçaları birlikte kullanılabilir.
   1. Bir odayı ve mikromanipülatörleri destekleyen bir alüminyum aşama kullanarak endotel tüplerini hazırlamak için tritürasyon aparatını13 monte edin. Objektiflerle donatılmış bir mikroskop (5x-60x) ve bir bilgisayar monitörüne bağlı bir kamera monte edin. Sahnenin ve numunenin yanında bir pompa kontrolörü ile bir mikroşırıngaya sabitleyin.
   2. Mineral yağ ile doldurulmuş bir öğütme pipetini mikroşırınga pistonunun üzerine sabitleyin. Pipette hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederken, ayrışma solüsyonunu mineral yağın üzerindeki öğütme pipetine (~ 130 nL) çekmek için pompa kontrolörü ile mikroşırıngayı kullanın.
2. Arteriolar segmentlerin kısmi sindirimi
   1. Sağlam arteriolar segmentleri 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditioeritritol, 250 μg / mL kollajenaz ve 40 μg / mL elastaz içeren 10 mL'lik bir cam tüpte 1 mL ayrışma çözeltisine yerleştirin. Arteriolar segmentleri 34 ° C'de 10-12 dakika inkübe edin.
   2. Sindirimden sonra, enzim çözeltisini oda sıcaklığında 3-4 mL taze ayrışma çözeltisi ile değiştirin.
3. Arteriolar endotel tüpü
   izolasyonu NOT: Enzim çözeltisinin sindirilmesini ve değiştirilmesini takiben, bir veya daha fazla kısmen sindirilmiş segmenti, mobil bir platforma bağlı bir süper füzyon odasında ayrışma çözeltisine aktarın. 100x ila 200x büyütmede görüntülerken, kısmen sindirilmiş ancak kırılmamış bir damar segmenti seçin ve mikroskop altında ona odaklanın.
   1. Mikroşırınga enjektörüne bağlı öğütme pipetini haznedeki ayrışma solüsyonuna yerleştirin ve sindirilmiş kap segmentinin bir ucuna yakın konumlandırın. Nazik öğütme için pompa kontrol cihazında 1-3 nL/s aralığında bir hız ayarlayın.
   2. 100x ila 200x büyütmeyi korurken, arteriolar segmenti pipete çekin ve ardından adventitia ve düz kas hücrelerini ayırmak için çıkarın (Şekil 1B). Tüm düz kas hücreleri ayrışana ve sadece endotel hücreleri sağlam bir "tüp" olarak kalana kadar damar segmentini tritura edin.
      not: Tritürasyon sırasında gerekirse, ayrışmış adventitia'yı ve iç elastik laminayı endotel tüpünden çıkarmak için dikkatlice ince uçlu forseps kullanın. Tipik olarak, sadece birkaç tritürasyon döngüsü sağlam bir endotel tüpü verir.
   3. Endotel tüpünün her iki ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri ile haznedeki cam lamel üzerine sabitlemek için mikromanipülatörler kullanın (Şekil 2C,D).
4. Arteriolar endotel tüpünün sabitlenmesi
   1. Ayrışma solüsyonunu süperfüzyon solüsyonu (2 mM CaCl₂ içeren PSS) ile değiştirin ve endotel olmayan materyalin hazneden yıkandığından emin olun.
   2. Mobil platformdaki güvenli endotel tüpünü, sürekli süperfüzyon ve hücre içi veya floresan kayıtlar/görüntüleme için tasarlanmış mikroskop donanımına aktarın.
   3. Deneme sırasında PSS'nin sürekli teslimini uygulayın. Çözelti akışının beslemesini vakum emme derecesine göre eşleştirirken, laminer akışla tutarlı olarak hat içi akış kontrol valfini kullanarak deney boyunca akış hızını (5-7 mL / dak) manuel olarak ayarlayın. Arka plan verilerini ve / veya boya yüklemesini almadan önce endotel tüpünün süperfüzyonu için odaya ≥5 dakikalık PSS akışına izin verin.

Sonuçlar

Şekil 1: Parankimal arteriyollerin diseksiyonu ve izolasyonu. (A) Sağlam Willis Çemberi ile izole edilmiş fare beyni. (B) MCA'yı (beyaz ok) içeren disseke edilmiş dikdörtgen bir beyin dokusu parçası. (C) Pia'nın dokunun üst kısmından izolasyonu (arteriyol, mavi ok). (D) Orta serebral arterlere (sarı oklar) bağlı arteriyoller (mavi ok uçları ile özetlenmiştir). (E) Beyin dokusunda tanımlanmış arteriol ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Banyo Soğutucu (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Bilimsel	13874647
Borosilikat cam kılcal damarlar (Sabitleme)	Warner Enstrümanları	G150T-6
Borosilikat cam kılcal damarlar (Keskin Elektrotlar)	Warner Enstrümanları	GC100F-10
Borosilikat cam kılcal damarlar (Trituration)	Dünya Hassas Aletleri (WPI), Sarasota, FL, ABD	1B100-4
BSA: Sığır Serum Albümini	Sigma	A7906
CaCl2: Kalsiyum Klorür	Sigma	223506
Kollajenaz (H Tipi Karışım)	Sigma	C8051
Veri Edinme Sayısallaştırıcı	Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD	Dijital veri 1550A
Diseksiyon Kabı (Kömür Sylgard tabanlı Cam Petri)	Yaşam Sistemleri Enstrümantasyonu, St. Albans City, VT, ABD	DD-90-S-BLK
Ditiyoeritritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimetil Sülfoksit	Sigma	D8418
Elastaz (domuz pankreası)	Sigma	E7885
Akış Kontrol Vanası	Warner Enstrümanları	FR-50
Floresan sistem arayüzü, ARC lambası ve güç kaynağı, hiper anahtar ve PMT	Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD	IonOptix Sistemleri
Forseps (İnce uçlu, keskinleştirilmiş)	FST (Türkçe)	Dumont #5 ve Dumont #55
glikoz	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri)	G7021
HEPES: (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit)	Sigma	H4034
KCl: Potasyum Klorür	Sigma	P9541 Serisi
MgCl2: Magnezyum Klorür	Sigma	M2670
Mikromanipülatör	Siskiyou	MX10
Mikropipet çektirme (dijital)	Sutter Aletleri, Novato, CA, ABD	P-97 veya P-1000
Mikroskop (Nikon ters çevrilmiş)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, Amerika Birleşik Devletleri	Ts2
Mikroskop (Nikon ters çevrilmiş)	Nikon Instruments Inc	Tutulma TS100
Mikroskop Tablası (Alüminyum)	Siskiyou, Hibe Kartı, VEYA, ABD	8090P
Mikroşırınga Pompa Kontrol Cihazı	Dünya Hassas Aletleri (WPI), Sarasota, FL, ABD	SYS-MICRO4
NaCl: Sodyum Klorür	Sigma	S7653 Serisi
Papaz Otu	Sigma	P4762 Serisi
Faz kontrastı hedefleri	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X ve 20X)
Makas (3 mm ve 7 mm bıçaklar)	Güzel Bilim Araçları (veya FST), Foster City, CA, ABD	Moria MC52 ve 15000-00
Makas (Vannas stili; 9,5 mm ve 3 mm bıçaklar)	Dünya Hassas Aletler	555640S, 14364
Sıcaklık Kontrol Cihazı (Çift Kanallı)	Warner Enstrümanları	TC-344B veya C
Valf Kontrol Sistemi	Warner Enstrümanları	VC-6

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Belediyesi Serisi Serisi