Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Sığır intervertebral diskinin diseksiyonu
- Yüzeydeki kiri ve tüyleri temizlemek için tüm kuyruğu musluk suyuyla iyice durulayın.
not: Sağlam, distal uçlarla, IVD'lerin istenen boyutuna bağlı olarak deneyler için kuyruk başına maksimum 9 intervertebral disk (IVD) (koksigeal 1-9) kullanılabilir. İstenilen çapın 15-20 mm arasında olduğu göz önüne alındığında, deneyler için kuyruk başına 5 IVD olacak şekilde 12 sığır kuyruğu kullandık.
- Tüm kuyruğu 10 dakika boyunca% 1 betadin çözeltisi içeren bir kutuya daldırın. Kuyruğu steril gazlı bezle kısa bir süre kurulayın ve steril bir örtü üzerine yerleştirin.
not: Diskin diseksiyonu sırasında, dehidrasyonu önlemek için kuyrukları Ringer'ın solüsyonuyla ıslatılmış gazlı bezle nemlendirin. Tüm diseksiyon prosedürü tamamlanana kadar kuyrukları (veya kalan parçaları) ıslak gazlı bezle sarılı olarak saklayın.
- IVD'lerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için yumuşak dokuyu kaudal omurgadan mümkün olduğunca tamamen çıkarmak için bir neşter (No. 20) kullanın. Omurların dikenli ve enine süreçlerini kemik çıkarma pensesi ile çıkarın.
not: İstenilen çapa sahip IVD'leri seçin. Bu çalışmada 15-20 mm çap aralığına sahip IVD'ler kullanılmıştır.
- Bireysel hareket segmentleri elde etmek için her bir omur gövdesinin ortasından kemik pensesi ile enine kesin. Hareket segmentlerini Ringer solüsyonu ile ıslatılmış gazlı bez ile bir Petri kabına koyun.
- IVD'yi ve omuru palpasyonla ve hareket segmentlerini nazikçe hareket ettirerek bulun. Şerit testere ile IVD'lerin büyüme plakasında, IVD'nin her iki tarafında birer tane olmak üzere iki paralel kesim yapın. IVD'den omurlara doğru yaklaşık 0,5-1 mm'lik bir güvenlik mesafesi ile diske (yumuşak) bitişik kemikli uç plaka parçasının (sert) dışbükey bölgesine dokunarak ve bularak büyüme plakasının yerini belirleyin. Omurları keserken şerit testerenin bıçağının Ringer solüsyonu ile soğutulduğundan emin olun.
- IVD'leri Ringer solüsyonu ile ıslatılmış temiz bir gazlı bez ile temiz bir Petri kabına aktarın.
not: IVD'lerin şişmesini önlemek için gazlı bez nemlendirilmeli ve çok ıslak olmamalıdır,
- Omur gövdesini (kırmızı/pembe kemik), büyüme plakasını (beyaz kıkırdak) sıyırmak için neşter bıçağını kullanın, uç plakayı sağlam bırakın (sarı-pembe). Yükleme prosedürü için iki yüzeyi düz ve paralel hale getirin. Kazınmış IVD'leri, Ringer solüsyonu ile ıslatılmış gazlı bez ile taze bir Petri kabına aktarın.
not: IVD'yi tutarken ve kazırken elinizi korumak için bir zincir eldiven giyin.
- Disk yüksekliğini ve çapını bir kumpas ile ölçün. Omur kemiğindeki kan pıhtılarını bir jet lavaj sistemi kullanarak Ringer solüsyonu ile temizleyin.
- IVD'leri, tüp başına bir IVD olmak üzere 50 mL plastik tüplere aktarın. IVD başına 25 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) +% 10 Penisilin / Streptomisin (P / S) ekleyin ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika çalkalamaya bırakın.
- Süpernatanı aspire edin ve IVD'leri durulamak için 2 dakika boyunca IVD başına 10 mL PBS +% 1 P / S ekleyin.
2. IVD kültürü ve yükleme
- Diskleri IVD odalarına aktarın ve IVD kültür ortamı ekleyin (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, fizyolojik grup için 4.5 g / L yüksek glikoz DMEM ve patolojik grup için 2 g / L düşük glikoz DMEM) +% 1 P / S +% 2 fetal buzağı serumu +% 1 ITS (5 μg / mL insülin, 6 μg / mL transferrin içerir, ve 5 ng/mL selenöz asit) + 50 μg/mL askorbat-2-fosfat +% 1 esansiyel olmayan amino asit + birincil hücreler için 50 μg / mL antimikrobiyal ajan) ve 37 ° C,% 85 nem ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Deney gruplarına göre diskleri bir biyoreaktör sistemi içinde 4 gün boyunca kültürleyin. Patolojik grupta, dejeneratif yükleme koşullarını 2 saat / gün boyunca 0.32-0.5 MPa, 5 Hz'de koruyun. Fizyolojik kontrol grubunda, 2 saat / gün için 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz'lik bir yükleme protokolü kullanın.
not: Yükleme prosedürleri sırasında IVD'leri 5 mL IVD ortamı içeren odalara yerleştirin. Hacim, biyoreaktörün yükleme odalarının boyutuna bağlıdır. Yükleme prosedürleri arasında, serbest şişme geri kazanımı için IVD'leri 7 mL IVD kültür ortamı içeren altı oyuklu plakalara yerleştirin.
- Deney süresi boyunca disk yüksekliğindeki değişiklikleri analiz etmek için, IVD diseksiyonundan sonra (taban çizgisi) ve ardından serbest şişme döneminden sonra ve deney süresi boyunca dinamik yüklemeden sonra günlük olarak disk yüksekliğini bir kumpas ile ölçün.
