Tasarlanmış Lentivirüsler Kullanılarak Nöronlarda İnsan Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

Abstract

Kaynak: Assetta, B., et al., Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin, tetrasikline duyarlı elementin kontrolü altında nörojenik bir transkripsiyon faktörü geni taşıyan tasarlanmış lentivirüslerle transfekte edilerek nöronlara farklılaşmasını indükleme sürecini ve ardından bir tetrasiklin türevi ve olgunlaşma ortamı ile muameleyi göstermektedir.

Protocol

1. İnsan pluripotent kök hücrelerinden insan nöron indüksiyonu

1. Lentivirus hazırlığı (~ 5 gün, daha önce açıklandığı gibi ayrıntılı protokol)
   1. Transfeksiyon gerçekleştirirken ~% 40 birleşik olmalarını sağlamak için her T75 şişesinde ~ 1 milyon HEK293T hücre plakalayın. Bunları tetrasiklin ile indüklenebilir Ngn2 ve puromisine dirençli geni (PuroR; aynı TetO promotör kontrolü altında), rtTA ve üç yardımcı plazmid pRSV-REV, pMDLg/pRRE ve VSV-G (12 μg lentiviral vektör DNA'sı ve yardımcı plazmit DNA'sının her birinin 6 μg'ı) eksprese eden plazmitlerle transfekte edin. Lentivirüs preparatı başına en az üç şişe hazırlayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek transfeksiyon için PEI kullanın. Ortamı 16 saat sonra değiştirin ve atın.
   2. Her gün kültür ortamını toplayarak salınan viral parçacıkları hasat edin ve 3 gün boyunca taze ortamla değiştirin. Saflaştırma için viral partiküller içeren toplanan ortamı bir araya getirin. Virüsü 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 90 dakika boyunca 49.000 x g'da santrifüjleyin. Peleti uygun hacimde PBS-glikoz (~ 150 μL) yeniden süspanse edin.
2. Nöron İndüksiyonu (~ 5 gün)
   not: Bu indüksiyon protokolü (Şekil 1A; akış diyagramı), doğrulanmış pluripotentliğe sahip hem iPS hem de ES hücreleri için oldukça etkilidir (bu, iyi karakterize edilmiş pluripotents belirteçlerinin immünohistokimya boyaması ile test edilebilir; Şekil 1B).
   1. 52'nin geçişinde ticari olarak temin edilebilen H1 insan ES hücrelerini kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreleri, hücre dışı matris çözeltisi kaplı 6 oyuklu plakalar (6 oyuklu plaka başına ~ 0.5 mg matris çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) ES hücre bakım ortamı kullanarak kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve plakaları% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.
   2. -2. Günde, ES hücrelerini (% 80 birleşik) 1 mL hücre ayırma çözeltisi ile ayırın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri bir tüpe aktarın; İyiliği 2 mL ortamla yıkayın ve aynı tüpte birleştirin. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, peleti ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, oyuk başına 1 x 10₅ hücrelik tohumlama yoğunluğunda matris kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin.
   3. -1. Günde, Ngn2 artı PuroR ve rtTA'yı polibren (8 μg / ml) ile birlikte eksprese eden lentivirüsleri taze ES hücre bakım ortamındaki ES hücrelerine ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Virüslerin tam miktarı, gerçek titreler veya titrasyon ile belirlenmelidir. Tipik olarak 6 oyuklu bir plakada her bir virüsü oyuk başına 5 μL ekleriz.
   4. 0. Günde, morfojen içermeyen N2 takviyesi ile DMEM-F12 ortamında Doksisiklin (Ngn2 ekspresyonunu aktive etmek için 2 μg / mL) ekleyin.
   5. 1. Günde, 1 μg / mL ortamın son konsantrasyonuna kadar taze DMEM-F12 artı N2 ve doksisiklin ortamında Puromisin ekleyin. Virüs titresi düşükse, yetersiz transdüksiyonlu hücreleri yeterince çıkarmak için daha yüksek Puromisin konsantrasyonu (5 μg / mL'ye kadar) ve daha uzun seçim süresi (48 saate kadar) gerekebilir.
   6. 2. Günde, farklılaşan nöronları hücre ayırma solüsyonu ile ayırın (Malzeme Tablosuna bakınız), matris solüsyonu ile kaplanmış 24 oyuklu plakalara (80.000-200.000 hücre / kuyu arasında) yeniden plakalayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları doksisiklin içermeyen NBA / B27 ortamında tutun. Tohumlama yoğunluğu kritiktir.
   7. Bu aşamada, ayrılan nöronlar özel bir ticari dondurma ortamında dondurulabilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 aya kadar sıvı nitrojen içinde saklanabilir. Saf nöronlar, çözülme sonrası tipik ~% 15 -% 20 hücre ölümü hesaba katılarak, tek başına kültürlenerek veya diğer beyin hücresi tipleriyle birlikte kültürlenerek kaplanabilir.
   8. Üretici tarafından talimat verildiği şekilde hücre dışı matris bazlı çözeltilerle kaplanmış plakalar üzerindeki saf iN'leri kültürleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Karakteristik piramidal morfoloji 4. günde (ve 6. gün; Şekil 1C). Sinaps oluşumu 14. ila 16. gün gibi erken bir sürede tespit edilebilir ve 24. günde standart pre- ve post-sinaptik belirteçlerle immünohistokimyasal boyama ile belirgindir. (Şekil 1D; pre-sinaptik belirteç Synapsin 1 ve dendritik belirteç Map2 ile etiketlenmiştir).

Results

Şekil 1: hPSC'lerden insan kaynaklı nöronların (iN'ler) Doğrudan Üretimi. (A) iN üretiminin akış diyagramı. (B) Pluripotentliği doğrulamak için insan pluripotent kök hücrelerinin (H1) başlangıç kültürünün temsili parlak alan ve immünofloresan görüntüleri. Oct4 kırmızı ve Sox2 yeşil olarak gösterilir. (C) 4. ve 6. gündeki iNs'nin temsili parlak alan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aktataz	KÖK HÜCRE Teknolojileri	7920
B27 takviyesi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	17504044
DMEM/F12 orta	KÖK HÜCRE Teknolojileri	36254
DMSO (Türkçe)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	D12345
Doksisiklin	MilliporeSigma	D3072
H1 insan ES hücreleri	Wi Hücresi	WA01
Matrigel (Matrijel)	Corning	354234
mTeSR artı	KÖK HÜCRE Teknolojileri	5825
N2 takviyesi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	17502001
Nörobazal A ortamı	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	10888-022
Esansiyel Olmayan Amino Asitler	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11140-050
Pei	VWR (VWR)	71002-812
pMDLg/pRRE	Ekle	12251
Polibren	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Ekle	12253
Puromisin	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A1113803
STEMdiff Nöral Progenitör Dondurma Ortamı	KÖK HÜCRE Teknolojileri	5838
STEMdiff SMADi Nöral İndüksiyon Kiti	KÖK HÜCRE Teknolojileri	8581
Tempo-iOlogo: İnsan iPSC'den türetilen OPC'ler	Tempo Biyobilim	SKU102
TetO-NG2-PURO	Ekle	52047
VSV-G	Ekle	12259