Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Abstract

Kaynak: Hubbard, K. et al., Kök Hücre Kaynaklı Merkezi Sinir Sistemi Nöronlarının Ağa Bağlı Kültürlerinde Biyolojik Nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirmesi.J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, işleyen sinapslara sahip ağa bağlı bir nöron popülasyonuna embriyonik kök hücre farklılaşması için bir tekniği göstermektedir. Embriyonik kök hücrenin nöronlara farklılaşması, nöronal ağ oluşumunun indüklenmesi ve kültürün ağa bağlı nöronlarla zenginleştirilmesi ile ilgili aşamaları ana hatlarıyla belirtir.

Protocol

1. Nöronal Farklılaşma

>NOT: Öğleden önce 1.1 - 1.5 adımlarını ve öğleden sonra 1.7 adımını uygulayın. Farklılaştırma prosedürlerine genel bir bakış Şekil 1A'da sunulmuştur.

1. 350 μl (3,5 x 10⁶) ESC'yi 25 ml farklılaştırma ortamı içeren 10 cm'lik düşük bağlantılı bir kaba aktarın. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatörü içinde 30 - 45 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya_{yerleştirin.} Bu, in vitro gün (DIV) -8.
   olarak adlandırılan farklılaşmanın ilk günüdür not: Ultra düşük bir bağlantı kabının kullanılması, yöntemin maliyetini artırır, ancak agregalar bazen Petri kaplarına yapışabileceğinden, bakteriyel Petri kaplarından biraz daha büyük verim sağlar. Farklı tabak boyutları tercih edilirse, orta hacimler ve hücre sayıları buna göre ölçeklendirilebilir.
2. 48 saat (DIV -6) sonra, farklılaşan hücre agregalarını 50 ml'lik konik bir tüpe aktarmak için 25 ml'lik bir pipet kullanın. Petri kabına hemen 25 ml'lik taze bir farklılaşma ortamı ekleyin.
3. Agregaların 2 - 5 dakikadan fazla çökmesine izin verin, 1 - 2 mm derinliğinde görünür bir pelet üretin. Süspansiyonda kalan tek hücreleri veya küçük agregaları göz ardı edin. Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini bir P1000 kullanarak petri kabına geri aktarın. Bir doku kültürü inkübatöründe döner çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
4. DIV -4'te adım 1.2'yi tekrarlayın. Pelet 2 - 4 mm derinliğinde olacaktır. 6 μM all-trans retinoik asit (RA) ile takviye edilmiş 30 ml farklılaşma ortamını petri kabına değiştirin. 48 saat daha doku kültürü inkübatöründeki döner çalkalayıcıya geri dönün.
5. DIV -2'de adım 1.3'ü tekrarlayın. Pelet bu noktada 4 - 8 mm derinliğinde olacaktır.
6. DIV -1'de kaplama yüzeylerini Bölüm 2'deki gibi hazırlayın.
7. DIV 0'da, 5 ml önceden ayrılmış ve dondurulmuş NPC tripsindirme ortamını 37 ° C'de 5 - 10 dakika boyunca çözdürün ve bir doku kültürü başlığına yerleştirin. 25 ml'lik bir pipet kullanarak, farklılaşan agregaları 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Agregaların çökelmesine ve ortamı dikkatlice aspire etmesine izin verin. Peletleri 10 ml PBS ile iki kez yıkayın, böylece agregaların yıkamalar arasında çökmesine izin verin.
8. İkinci PBS yıkamasından sonra, pelete 5 ml NPC tripsinizasyon ortamı ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
9. Tripsini inaktive etmek için 5 ml %0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Nispeten homojen bir hücre süspansiyonu üretilene kadar 10 ml'lik bir serolojik pipet ile 10 - 15 kez hafifçe ezin.
10. Hücre süspansiyonunu, 50 ml'lik konik bir tüpün üstüne yerleştirilmiş 40 μm veya 70 μm'lik bir hücre süzgecine yavaşça aktarın. Tüm süspansiyon süzüldükten sonra, kalan hücreleri filtreden yıkamak için 1 ml N2 ortamı ekleyin ve ayrışmış hücre süspansiyonunu 200 x g'da 6 dakika boyunca peletleyin.
11. Peleti bozmadan ortamı aspire edin. Hücreleri 10 ml N2 ortamı ile iki kez yıkayın, hücreleri 200 x g'da 5 dakika boyunca peletleyin ve yıkamalar arasında bir P1000 ile ezin. İkinci yıkamadan önce, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
12. N2 ortamındaki hücreleri ml başına 1 x 10⁷ hücrede yeniden süspanse edin ve 150.000 - 200.000 hücre /^cm2 hücre yoğunluğunda plaka ESN'leri.
13. Yeni kaplanmış ESN'leri 37 °C ve %5 CO_2'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörüne aktarın ve Bölüm 3'teki gibi muhafaza edin.

2. DIV 0'da Nöral Öncülleri Kaplamak için Kültür Yüzeylerinin Hazırlanması

1. Doku kültürü ile muamele edilmiş bulaşıkları kaplamadan en az 1 gün önce hazırlayın. Doku kültürü ile muamele edilmiş plastik tabakları kaplamak için yeterli polietilenimin (PEI; steril H₂O'da 25 μg / ml) veya poli-D-lizin (PDL; steril H₂O'da 100 μg / ml) ekleyin ve O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
2. Kaplama sabahı, bulaşıkları iki kez çift damıtılmış H₂O ve bir kez PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, tabağı kaplamak için yeterli N2 ortamı ekleyin (ör., 12 oyuklu bir tabağın oyuğu başına 1 ml veya 6 cm'lik tabak başına 4 ml).
3. Nöron kaplamadan en az bir gün önce 18 mm'lik cam lameller hazırlayın. Lamelleri 4 dakika boyunca plazma temizliği ile temizleyin.
4. Temizlenmiş lamelleri hemen büyük bir steril kabın dibindeki etanolle yıkanmış bir parafilme aktarın ve adım 2.1'deki gibi hazırlanan 400 μl PEI veya PDL çözeltisi ekleyin. O/N'yi 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
5. Sabahları, lamelleri üç kez suyla yıkayın ve 37 ° C'de 1 - 3 saat boyunca PBS'ye 5 μg / ml laminin ekleyin. Nöronları ayırmadan önce, laminini aspire edin ve lameli hemen 1 ml NPC ortamı içeren 12 oyuklu bir tabağın kuyusuna aktarın, tedavi edilen tarafı yukarı bakacak şekilde tuttuğunuzdan emin olun.
6. Bulaşıkları ve lamelleri NPC'ler tabağa hazır olana kadar 37 °C'de saklayın.

3. Nöronların Bakımı

1. DIV 1'de, besiyerini aspire edin ve N2 kültür besiyeri ile değiştirin.
2. DIV 2 ve 4'te besiyerini aspire edin ve B27 kültür besiyeri ile değiştirin.
3. DIV 8'de, besiyerini aspire edin ve kontamine nöronal olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için mitotik inhibitörler içeren B27 kültür ortamı ile değiştirin.
4. DIV 12'de B27 kültür ortamı ile değiştirin.
5. DIV 12⁺ ESN'leri kullanıma hazır olana kadar %5 CO_2'den çıkarmayın.

Results

Şekil 1. Süspansiyona uyarlanmış ESN'ler mitotik olarak stabil kalır ve pluripotentlik belirteçlerini ifade eder.(A) ESC bakım ve farklılaşma şeması. Retinoik asit (RA) veya lösemi inhibitör faktörünün (LIF) varlığı veya yokluğu + veya - ile işaretlenir. Primer nöron kültürleri için in vitro (DIV) ve klasik gelişim aşamaları (DS) arasında bir karşılaştırma sağlanmıştır. (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nakavt DMEM	Yaşam Teknolojileri	10829-018	Ortam: ESC kültür ortamı Formülasyon ve notlar: 500 mL
100x MEM NEAA	Yaşam Teknolojileri	11140-050	Ortam: 4 °C'de 1 aya kadar saklayın Formülasyon ve notlar: 6 mL
200 mM L-Alanil-L-Glutamin	ATCC (Uzay Servisi)	30-2115	6 mL
ES nitelikli FBS	Uygulanan Kök Hücre	ASM-5007	90 mL
100x antibiyotik	Sigma-Aldrich	A5955	3 mL
55 mM 2-merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985-023	1.1 mL
107 Birim/mL LIF	Kırlangıç	ESG1107	60 μL
Nakavt DMEM	Yaşam Teknolojileri	10829-018	Ortam: ESC farklılaşma ortamı Formülasyon ve notlar: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Yaşam Teknolojileri	11140-050	Ortam: 4 °C'de 1 aya kadar saklayın Formülasyon ve notlar: 5 mL
200 mM L-Alanil-L-Glutamin	ATCC (Uzay Servisi)	30-2115	5 mL
ESC onaylı serum	Uygulanan Kök Hücre	ASM-5007	50 mL
100x antibiyotik	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 mL
55 mM 2-merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985-023	0,9 mL
Dulbecco'nun PBS'si	Sigma-Aldrich	D8537	Medya: NPC tripsinizasyon ortamı Formülasyon ve notlar: 100 mL
0,5 M EDTA (% 18,3)	Sigma-Aldrich	3690	Ortam: 5 mL alikotta dondurun Formülasyon ve notlar: 0.266 mL
Tripsin	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
Polietilenimin (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143 Serisi	Medya: Yüzey kaplama çözeltileri Formülasyon ve notlar: H20'de 2,5 μg/mL
Poli-D-lizin (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280 Serisi	Ortam: 1 hafta içinde kullanın Formülasyon ve notlar: H20'de 100 μg/mL
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	H20 içinde 5 μg/mL
DMEM/F12 + GlutaMAX	Yaşam Teknolojileri	10565-018	Medya: NPC kültür ortamı Formülasyon ve notlar: 492,5 mL
100x N2 vitamini	Yaşam Teknolojileri	17502-048	Ortam: 4 °C'de 1 aya kadar saklayın Formülasyon ve notlar: 5 mL
100x antibiyotik	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 mL
Nörobazal A	Yaşam Teknolojileri	10888-022	Ortam: ESN kültür ortamı Formülasyon ve notlar: 482,5 mL
50x B27 vitamini	Yaşam Teknolojileri	17504-044	Ortam: 4 °C'de 1 aya kadar saklayın Formülasyon ve notlar: 10 mL
200 mM L-Alanil-L-Glutamin	ATCC (Uzay Servisi)	30-2115	5 mL
100x antibiyotik	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 mL
5-floro-2'-deoksiüridin (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Ortam: 2000x Mitotik inhibitörler alikot ve -20 ° C'de saklayın Formülasyon ve notlar: dd 150 mg 5FDU ve 350 mg üridin ila 10 mL Nörobazal A. Steril filtre, alikot ve dondurma. ESN kültür ortamında 2000x kullanın.
üridin	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Ekspres Tripsin	Yaşam Teknolojileri	12605-010	Medya: Çeşitli Formülasyon ve notlar: RT'de saklayın
DMSO (Türkçe)	Sigma-Aldrich	D8418	RT'de mağaza
soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI)	Sigma-Aldrich	T6414	-20 °C'de saklayın
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	RT'de mağaza
askorbik asit	Sigma-Aldrich	A4403	100 mg askorbik asidi 5.7 mL 50:50 DMSO / etanol karışımı içinde çözerek 100 mM stok hazırlayın.
retinoik asit (RA)	Sigma-Aldrich	R2625 Serisi	15 mg RA'yı 9 mL 50:50 DMSO / etanol içinde yeniden süspanse edin. 1 mL 100 mM askorbik asit stoğu ile takviye edin. Aliquot ve -80 °C'de saklanır. 6 ay boyunca kararlıdır.
plazma temizleyici	Harrick Plazma	PDC-32G
Olympus IX51 ters mikroskop	Olympus	Yok
18 mm cam lameller	balıkçı	12-545-84
Hücre süzgeci (40 μm)	balıkçı	08-771-1
Stovall Dansöz Çalkalayıcı	balıkçı	15-453-211
Düşük yapışma özelliğine sahip tabaklar	balıkçı	05-539-101	İkinci El Corning 3262
Bakteriyel Yemekler	VWR (VWR)	25384-302	100 x 15 mm