Schwann Hücrelerinin Fare Siyatik Sinirlerinden Manyetik Olarak Ayrılması

Özet

Kaynak: Blusch, A., et al., Sıçan Dorsal Kök Ganglion Eksplantları ve Schwann Hücrelerinin Kokültüründe Periferik Aksonların İn Vitro Miyelinasyonu. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, Schwann hücrelerini fare siyatik sinir liflerinden izole etmek için bir yöntemi göstermektedir.

Protokol

1. Schwann hücre kültürü

1. Schwann hücre kültürü için kaplama
   1. Hücre kültürü kaplarını steril koşullar altında kaplayın. Her biri iki adet 60 mm doku kültürü (TC) kabına 2 mL %0.01 poli-L-lizin (PLL) uygulayın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   2. PLL'yi çıkarın, TC bulaşıklarını 2x damıtılmış suyla yıkayın ve gece boyunca 4 °C'de 2 mL 1 μg/cm² laminin ile inkübe edin. TC bulaşıklarını 2x aqua dest ile yıkayın ve plakaların kurumasını bekleyin.
2. Schwann hücre kültürü için besiyeri hazırlama
   1. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'a (DMEM) / F-12'ye (yüksek glikoz)% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 μM forskolin, 10 nM nM nöregulin ve 50 μg / mL gentamisin ekleyerek 50 mL Schwann hücre ortamı hazırlayın.
   2. Steril koşullar altında 50 μg / mL gentamisin ile 70 mL Leibovitz'in L-15 ortamını hazırlayın.
3. Siyatik sinirin enzimatik sindirimi
   NOT: Sonraki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilir.
   1. 10 mL DMEM (yüksek glikoz) içinde% 0.25 dispas II,% 0.05 tip I kollajenaz ve% 50 μg / mL gentamisin içeren enzimatik sindirim çözeltisini hazırlayın.
   2. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı 25 mL'lik bir serolojik pipetle çıkarın ve peleti kalan Leibovitz'in L-15 ortamıyla birlikte 1.000 mL'lik bir pipet kullanarak 60 mm'lik bir doku kültürü kabına aktarın.
   3. 50 mL'lik tüpü 10 mL enzimatik sindirim solüsyonu ile durulayın ve sinir liflerini içeren tabağa ekleyin. Sindirim için erişilebilir yüzeyi en üst düzeye çıkarmak için dokuyu bir pipetin ucuyla dikkatlice tabağa dağıtın.
   4. 37 ° C ve% 5 CO₂'de 18 saat inkübe edin ve Hanks'in dengeli tuz çözeltisine Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} (HBSS) olmadan 10 mL% 40 FCS ekleyerek sindirimi durdurun.
4. Hücre ayırma
   1. Sindirilmiş sinirleri serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin içeren 10 mL DMEM'de yeniden süspanse edin. 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL ve 200 μL pipet ucu kullanarak peleti daha sonra 20 kez yeniden süspanse edin.
   2. Hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin içeren 4 mL DMEM ile yeniden süspanse edin.
   3. İki PLL ve laminin kaplı 60 mm TC kabının her birine 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin. Hücreleri mekanik stresten korumak ve uyumu desteklemek için plakaları 2 gün boyunca inkübatörde el değmeden bırakın.
5. Schwann hücre farklılaşması
   1. 2 gün sonra, ortamı çıkarın ve plakaları 2x DMEM (yüksek glikoz),% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin ile dikkatlice durulayın. Daha sonra, 2 mL Schwann hücre ortamı ekleyin. Schwann hücre ortamını her 2 günde bir değiştirin ve bir mikroskop kullanarak hücre görünümünü ve birleşmesini gözlemleyin.
6. Hücre tripsinizasyonu ve manyetik ayırma
   1. Hücreler yaklaşık% 80'lik bir birleşmeye ulaştığında (6-12 günlük kültür), plakaları 2x 3 mL DPBS ile dikkatlice yıkayın ve 2 mL% 0.05 Tripsin / EDTA (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile 3 dakika inkübe edin. Hücreler plaka tabanından ayrıldığında,% 10 FCS ve% 50 μg / mL gentamisin ile 2 mL DMEM ilavesiyle sindirimi etkisiz hale getirin.
      not: Kesinlikle 3 dakikalık bir tripsinizasyon süresine bağlı kalın ve daha sonra hızlı bir şekilde ilerleyin.
   2. Hücre peletini% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 nM EDTA ile DPBS içeren 2 mL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile birleştirin ve bir boyama odası kullanarak hücreleri sayın.
   3. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini 1 x 10⁷ hücre başına 90 μL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. 1 x 10⁷ hücre başına 10 μL Thy-1 mikro boncuk ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez tekrar süspanse edin ve karanlıkta 8 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
   4. Hücre süspansiyonuna 2 mL manyetik hücre ayırma tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.
   5. Manyetik hücre ayırma kolonunu 1 mL manyetik hücre ayırma tamponu ile nemlendirin. Manyetik hücre ayırma sütununu manyetik hücre ayırıcısına yerleştirin. Hücreleri manyetik hücre ayırma sütununa uygulayın. Akışı toplayın ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüjleyin < br /> not: Fibroblastlar pozitif olarak seçilir ve kolonda kalırken, Schwann hücreleri kolonu geçer. Fibroblastlar bir damga ile toplanabilir (örneğin, Schwann hücre boyama protokolleri için negatif bir kontrol olarak).
   6. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL kokültür ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi ve bir boyama odası ile boyamadan sonra hücreleri sayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır serum albümini	Carl Roth, Karlsruhe, Almanya	8076.4
Hücre süzgeci, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Almanya	352360
Santrifüj 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	5811000015
CO2 İnkübatörü Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Almanya	51017865
Dispas II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	4942078001
Damıtılmış su (Su Arıtma Sistemi)	Millipore, Molsheim, Fransa	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	31331093
DPBS (kalsiyum iyonu ve magnezyum iyonu yok)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	F7524	FCS, Schwann hücre kültürü için test edilmelidir
Gentamisin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	5710064
HBSS (kalsiyum iyonu ve magnezyum iyonu yok)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	14170138
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	L2020-1MG
MACS Çoklu Stand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya	130042303
Mikro makas	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya	15000-08
mikroskop	Motic, Wetzlar, Almanya	Motic BA 400
Mikroskop lamı	VWR, Radnor, Amerika Birleşik Devletleri	630-1985
MiniMACS ayırıcı	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya	130091632
MS sütunları	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya	130-042-201
Neubauer sayma odası	Asistan, Erlangen, Almanya	40441
Pipetler	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	2231300004
Poli-L-Lizin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	P4707-50ML
Serolojik pipet, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Almanya	861254025
Serolojik pipet, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Almanya	861685001
Serolojik pipet, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Almanya	861253001
TC kabı 60, hücre +	Sarstedt, Nümbrecht, Almanya	833901300
Thy-1 Mikro Boncuklar (MACS Kiti)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya	130-094-523
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	25300-054
Tip I Kollajenaz	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya	C1639 Serisi
Su banyosu tipi 1008	GFL, Burgwedel, Almanya	4285

Serisi Serisi yılları arasında Serisi