$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Yüksek sükroz dilimi çözeltisi ve yapay beyin omurilik sıvısının (ACSF) hazırlanması
- Deney gününden önce
- (mM cinsinden) aşağıdakileri içeren laboratuvar sınıfı Tip 1 su ile 1 L 10x dilim ön çözelti hazırlayın: 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgS04, 12.5 KH 2PO4 (Tablo 1). Kalsiyum fosfat çökelmesini önlemek için, kimyasalları 800 mL H2O ile önceden doldurulmuş bir beherde, manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırarak yavaşça karıştırın. Solüsyonu 4 °C veya oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- Deney gününde
- 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glikoz içeren laboratuvar sınıfı Tip 1 su ile 1 L 1x ACSF hazırlayın (Tablo 2). 305–315 mOsm (pH ~ 7.55–7.6) arasındaki ozmolariteyi doğrulamak için bir buhar basıncı ozmometresi kullanın.
not: Kalsiyum fosfat çökelmesini önlemek için, tüm katı kimyasalları manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırarak 800 mL H2O ile önceden doldurulmuş bir beherde yavaşça karıştırın. En sonundaMgS04 ve CaCl2'yi ekleyin, 1 M stok çözeltilerinden gerekli miktarda yavaşça damlatın.
- PH'ı 7.3–7.4.
arasında ayarlamak için RT'de karbojen ile sürekli olarak 1x ACSF çözeltisi köpürtün
not: PH biraz fazla yüksek veya çok düşükse, karbojenasyon kuvvetinde küçük ayarlamalar yeterli olacaktır. Karbojenasyon ile pH 7.45'ten yüksekse, birkaç damla 1 M NaH2PO4 çözeltisi ekleyerek ayarlayın.
- 25 mL 10x dilim ön çözelti ve (mM cinsinden): 252 Sükroz, 26 NaHCO3 ve 10 Glikoz içeren bir beherde 250 mL (beyin başına) 1x yüksek sükroz dilimi çözeltisi hazırlayın (Tablo 3). Ozmolaritenin 320–325 mOsm (pH ~ 7.55–7.6) arasında olduğunu doğrulayın.
- pH'ı 7,3–7,4,
arasında kontrol etmek için yüksek sükroz dilim çözeltisini 10-15 dakika karbojen ile köpürtün
not: Karbojenasyon ile pH 7.45'ten yüksekse, birkaç damla 1 M KH2PO4 çözeltisi ekleyerek ayarlayın.
- Yüksek sükroz dilim solüsyonunu kısmen donana kadar ultra dondurucuda (-80 °C) 20-30 dakika saklayın.
2. Murin beyninin diseksiyonu ve konumlandırılması
- Beyni soğutulmuş 35 mm'lik kültür kabına aktarın ve beyni ACSF dolgulu bir Pasteur pipeti ile nazikçe yıkayarak dokudaki tüm saç veya kan parçacıklarını çıkarın (kanın beyin dokusu üzerinde sitotoksik etkileri vardır).
- Soğutulmuş 90 mm'lik kültür kabının üzerine batırılmış filtre kağıdı üzerine spatula yardımıyla beyni aktarın (Şekil 1A).
- Beyni ikiye bölmek, iki yarım küreyi ayırmak için bir bıçak kullanın ve her iki yarım küreyi de yeni kesilmiş medial tarafa yerleştirin.
- Beynin dorsal kısmını (%5-10) her yarım küreden sırt tepesine paralel bir kesim ile çıkarmak için bir bıçak kullanın (Şekil 1C) ve her iki yarım küreyi de beynin ventral kısmı yukarı bakacak şekilde yeni kesilmiş tarafa yerleştirin.
- Numune plakasına bir damla süper yapıştırıcı yerleştirin ve her iki yarım küreyi de yerleştirmek için bir pipet ucuyla düzgün bir şekilde yayın.
- Filtre kağıdı kayışı ile ventral tarafa dokunarak kılcal kuvvetlerle bir yarım küreyi almak için bir filtre kağıdı kayışı kullanın, böylece dokuya zarar vermeyin.
Yarım küreyi- , sırt tarafı aşağı bakacak şekilde, numune plakası üzerindeki yapıştırıcının üzerine yerleştirmeden önce beynin sırt tarafını dikkatlice yarı kurutmak için başka bir filtre kağıdı kayışı kullanın. Aynı işlemi ikinci yarım küre ile tekrarlayın.
not: Yarım küreler, vibratom plakası üzerinde aynalı bir şekilde yatay hizada, rostral kenarlar dışa bakacak ve kaudal taraflar ortada birbirine bakacak (ancak değmeyecek) şekilde yerleştirilmelidir. Her iki hemisferin medial tarafları vibratom bıçağına ve yan tarafları deneyciye doğru bakmalıdır (Şekil 1D).
- Numune plakasını dilimleme haznesine yerleştirin ve hızlı ama dikkatli bir şekilde buz gibi yüksek sükroz dilim çözeltisi sulu karı ile örtün. Çözelti yapıştırıcıya temas eder etmez katılaşacak ve yarım küreleri numune plakasına düzgün bir şekilde yapıştıracaktır.
- Yarım kürelerin yüksek sükroz dilim çözeltisi ile düzgün bir şekilde kaplandığından emin olun ve çözeltinin karbojen ile köpürtüldüğünü onaylayın.
not: Tüm diseksiyon prosedürü mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Lütfen beynin çok uzun süre oksijen kaynağı olmadan kalmadığından emin olun. Yüksek sakaroz dilimi çözeltisi rüşvetine dekapitasyondan beynin daldırılmasına kadar sadece 1-1,5 dakika sürmelidir. Bu, dilimin yüksek kalitesini garanti etmek için akut beyin dilimi hazırlıkları için en kritik gerekliliktir.
3. Beynin yatay dilimlenmesi
- Vibratom bıçağını hemisferlerin medial tarafının önüne yerleştirin ve hemisferlerin şimdi yukarı bakan ventral tarafları ile aynı yüksekliğe indirin. Vibratom kontrolü yardımıyla bıçağı sırt yönünde 600 μm daha uzağa indirin ve dilimlemeye başlayın. Bıçak dokuya çarpmalıdır (değilse, bıçağı ters çevirin ve biraz daha indirin). İlk iki dilim iki yarım küreden tamamen ayrılana kadar dilimleyin.
- Bıçağı ters çevirin ve 300 μm daha indirin ve tekrar dilimleyin.
- Hipokampus görünür hale geldiğinde (gerekirse yardım için fare beyin atlasını kullanın) (Şekil 1E) dilimleri genişletilmiş plastik Pasteur pipeti ile toplayın. Kaudat putamen hipokampusun yanında görünür hale gelene kadar dilimleri toplayın. Tipik olarak, fare beyni için 300 μm'lik 8-12 dilim (yarım küre başına 4-6) toplanabilir.
- Dilimleri toplamak ve su banyosundaki geri kazanım odasına aktarmak için plastik Pasteur pipetini kullanın (Şekil 1F) (dilim haznesinde yüzmelerini önlemek için her dilimleme turundan sonra dilimleri toplayın).
not: Mümkün olduğunca hızlı çalışın ve yüksek sükroz dilimi çözeltisinin tüm prosedür boyunca buz gibi soğuk ve karbonjene olduğundan emin olun. Gerekirse, dilim haznesini çevreleyen buzu yeniden doldurun.
4. Elektrofizyolojik kayıtlar için beyin dilimlerinin kurtarılması
- Dilimleri ACSF dolgulu geri kazanım odasında 32 °C su banyosunda 1 saat <>
NOT: Geri kazanım odaları da ticari olarak temin edilebilir.
- Kurtarma odasını su banyosundan çıkarın.
- Daha fazla uygulamaya başlamadan önce dilimleri kurtarma için en az 30 dakika daha RT'ye yerleştirin.
>Buffer ve Medya Tarifleri.
Tablo 1: 10 x dilim ön çözelti (1 L).
| bileşik | Konsantrasyon (mM) | Molekül ağırlığı (g/mol) | Miktar (g) |
| Kartal | 25 | 74,55 | 1,86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147,01 | 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | 2,46 |
| KH2PO4 | 12,5 | 136,08 | 1.7 |
Tablo 2: 1x ACSF (1 L) (305–315 mOsm arasında ozmolarite).
| bileşik | Konsantrasyon (mM) | Molekül ağırlığı (g/mol) | Miktar (g) |
| NaCl (Doğal) | 125 | 58,44 | 7.3 |
| Kartal | 2,5 | 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | 2 | 1 M CaCl2 çözeltisinden | 2 mL |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | 1 MMgS04 çözeltisinden | 1 mL |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1,25 | 156,02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | 2,18 |
| Glikoz * H2O | 25 | 198,17 | 4,95 |
Tablo 3: 1x yüksek sükroz dilimi çözeltisi (250 mL) (ozmolarite 320-325 mOsm arasında).
| bileşik | Konsantrasyon (mM) | Molekül ağırlığı (g/mol) | Miktar (g) |
| 10x dilim ön çözümü | Yok | Yok | 25 mL |
| Sakaroz | 252 | 342.3 | 21,57 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | 0,55 |
| Glikoz * H2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
