Bir Fare Beyninden Eğik Amigdala Dilimlerinin Üretilmesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Bosch, D., et al. Beyin dilimlerinde korku devrelerinin ex vivo optogenetik diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, bir fare beyninden eğik amigdala dilimlerinin oluşturulmasını göstermektedir. Beyin, amigdala ile sinaptik bağlantılar oluşturan medial prefrontal korteksten amigdala ve aksonları içeren dilimler elde etmek için vibratom örneği aşamasında belirli bir açıyla konumlandırılır. Beyin dilimleri, daha sonraki deneyler için dokuyu korumak için fizyolojik sıcaklıkta tutulur.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Akut Dilimlerin Hazırlanması

Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF), kesme solüsyonu, aletler (makas, neşter, forseps, spatula, Pasteur pipeti) ve agar blokları hazırlayın.
Not: Deney başına 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) gereklidir ve kimyasalların daha önce yayınlandığı gibi çift damıtılmış H₂O içinde çözülmesiyle hazırlanır. Kesme çözeltisi, 200 ml ACSF'nin 0.87 ml 2 M_MgS04 stok çözeltisi ile desteklenmesiyle hazırlanır.
Deney boyunca %95_O2 ve %5 CO 2 ile ACSF ve kesme solüsyonunu oksijenlendirin_.
İzofluran (oksijende% 3) kullanarak küçük bir hayvan anestezi makinesi kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturun. Devam etmeden önce uzuv çekme refleksini kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin.
Büyük bir makas kullanarak farenin kafasını kesin ve kafayı hemen buz gibi soğuk kesme solüsyonunda soğutun.
Kaudalden rostral'a tek bir orta hat kesisi ile kafatasını açın ve forseps kullanarak kafatası parçalarını nazikçe yanlara doğru itin. Küçük, yuvarlak bir spatula kullanarak beyni nazikçe kafatasından kaldırarak hızla çıkarın. Beyincik neşter ile kesin. Beyni buz gibi soğuk kesme solüsyonuna yerleştirin.
Medial prefrontal korteks veya mPFC enjeksiyon bölgeleri için: beynin ön kısmını (mPFC içeren) bir neşter kullanarak kesin ve dilimleyene kadar buz gibi soğuk kesme solüsyonuna koyun.
Fazla kesme solüsyonunu filtre kağıdı ile çıkarın ve beynin arka kısmını vibratom aşamasına yapıştırın.
Eğik amigdala dilimleri için, beyni 35°'lik bir açıyla kesilmiş bir agar bloğu (%4) üzerine yapıştırın (Şekil 1D, orta). Koronal amigdala dilimleri, medial genikülat nükleus/ posterior intralaminar talamik çekirdek (MGm/PIN) enjeksiyon bölgeleri ve mPFC enjeksiyon bölgeleri için beyni doğrudan sahneye yapıştırın (Şekil 1D, sol ve sağ). Dilimleme sırasında stabilite için beynin arkasına ek bir agar bloğu yerleştirin.
Sahneyi, bir soğutma ünitesi kullanılarak 4 ° C'de tutulan buz gibi soğuk oksijenli kesme çözeltisi ile kesme odasına yerleştirin. Safir bir bıçak kullanarak amigdalanın (320 μm) akut dilimlerini hazırlayın. Dilimleri oda sıcaklığında (RT) oksijenli ACSF ile sağlanan bir arayüz odasına yerleştirin.
Akut amigdala dilimleri hazırlandıktan sonra, dilimleri 35 - 45 dakika boyunca geri kazanmak için arayüz odasını 36 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, arayüz odasını RT'ye geri getirin.
Adım 1.10'un başlangıcı sırasında, akut amigdala dilimleri için daha önce tarif edildiği gibi enjeksiyon bölgelerinin dilimlerini kesin (adım 1.8 - 1.9). Burada su banyosunda dilimlerin geri kazanılması gerekli değildir. opsiyonel: Enjeksiyon bölgesi konumunu hızlı bir şekilde tahmin etmek için, floresan lamba ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir stereoskop üzerindeki dilimleri gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1. Stereotaktik enjeksiyonlar, akut beyin dilimlerinin hazırlanması ve presinaptik liflerin görselleştirilmesi.(A, B) Stereotaktik virüs enjeksiyonu. A) Kafatası açıkta ve enjeksiyon pipeti ile stereotaktik bir çerçeveye yerleştirilmiş anestezi uygulanmış farenin resmi. İç: Hızlı yeşil ile karıştırılmış virüs çözeltisi ile doldurulmuş enjeksiyon pipetinin resmini yakınlaştırın. ...