Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir
>1. DG'nin diseksiyonu (Zamanlama: 15 dk)
- Çekirdek izolasyon ortamı 1 ve 2'yi (NIM1 ve NIM2), homojenizasyon tamponunu (HB) ve yıkama ortamını (WM) hazırlayın (Tablo 1). Tüm tamponları, ortamı, reaktifleri ve aletleri ihtiyaç duyulana kadar buzun üzerine yerleştirin. Dounce homojenizatörü (Malzeme Tablosuna bakın) hazırlık sırasında (homojenizasyon adımından en az 1 saat önce) buzun üzerine koyun.
not: NIM1, 4 ° C'de 6 aya kadar hazırlanabilir ve saklanabilir. NIM2, HB ve WM taze hazırlanmalıdır.
Dikkat: Proteaz inhibitörü olan ditiyotreitol (DTT) ve Triton X-100'ü dikkatli bir şekilde manipüle edin. Bu bileşikler cildi ve gözü tahriş eder, akut toksiktir ve su ortamı için tehlikelidir. Bu kimyasalları kullanırken koruyucu eldiven, giysi, göz ve yüz koruması kullanın, kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın ve çevreye salınmasını önleyin.
- 22 aylık bir erkek C57Bl / 6J faresini, Ev Ofisi Çizelge 1 prosedürünü takiben servikal çıkık ile ötenazi yapın.
not: Bu çalışmada 22 aylık farenin kullanımına ilişkin gerekçe için tartışmaya bakınız. Bununla birlikte, bu protokol yaşam boyu herhangi bir yaşta uygulanabilir.
- Beyni ötenazi yapılmış bir fareden çıkarın ve buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın (Şekil 1). Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Bir neşter kullanarak beyinciği çıkarın ve beyni her iki yarım küre arasında (sagital eksen boyunca) ikiye bölün.
- 10 cm'lik yeni bir Petri kabını buz gibi PBS ile doldurun ve buzun üzerine yerleştirin. Beynin bir yarısını yeni Petri kabına aktarın. Dürbün kullanarak DG'yi inceleyin ve beynin ikinci yarısından ikinci DG'yi elde etmek için bu adımı tekrarlayın.
not: Bu adımlar (adım 1.2-1.4) daha önce açıklanan bir prosedürden uyarlanmıştır. Hücrelerin bütünlüğünü korumak için bu aşamada mümkün olduğunca hızlı ilerlemek önemlidir.
- İki DG'yi önceden soğutulmuş Dounce homojenizatöre aktarın ve 1 mL soğuk HB ekleyin.
2. Doku ayrışması, tek çekirdek izolasyonu ve anti-NeuN immün boyama (Zamanlama: 2 saat)
- Dokuyu 10 vuruş gevşek "A" havaneli ve ardından 15 vuruş sıkı "B" havaneli ile homojenize edin.
not: Sürtünme ve köpüklenmeden kaynaklanan ısıyı azaltmak için harç buz üzerinde hafif darbelerle dounce homojenizasyonu yapılmalıdır. İşlem sırasında tüm tamponlar ve ekipmanlar önceden soğutulmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır.
- Homojenatı önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın; Dounce homojenizatörü 1 mL soğuk HB ile durulayın ve aynı tüpe birleştirin. 15 mL'lik tüpe 3 mL HB ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Tüpü hafifçe ters çevirerek 2x karıştırın.
- 70 μm'lik bir süzgeç kapağını 50 mL'lik bir test tüpü üzerinde 0,5 mL HB ile önceden ıslatın. 15 mL'lik tüpü nazikçe hücre süzgecine devirerek 2.2. adımdan itibaren çekirdek süspansiyonunu süzün. Hücre süzgecini 0,5 mL HB ile yıkayın.
- Hücre süzgecini çıkarın ve test tüpünü bir döner kova santrifüjü kullanarak 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
not: Homojenatın süzülmesi, akış sitometrisi ve tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) aşağı akış adımları için kritik olan kalıntıların azaltılmasına yardımcı olacaktır.
- Peleti bir P1000 pipeti kullanarak 4 mL HB'de nazikçe yeniden süspanse edin. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatanı atın ve peleti 3 mL WM'de yeniden süspanse edin.
- 35 μm'lik bir süzgeç kapağını 0,5 mL WM ile 15 mL'lik bir test tüpü üzerinde önceden ıslatın. Çekirdek süspansiyonunu 2.5. adımdan hücre süzgecinden süzün, bir P1000 pipeti kullanarak bir seferde 0,5 mL'yi hafifçe pipetleyin.
- Süzgeç kapağını 0,5 mL WM ile yıkayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Süzüntüyü 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 500 x g'da 5 dakika ve 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 3 mL WM içinde yeniden süspanse edin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatanı atın ve peleti fare anti-nöronal nükleer antijeni (NeuN), AlexaFluor 488-konjuge antikoru (anti-NeuN-AF488, 1: 32.000) ve 1 μg / mL 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile 1 mL WM'de yeniden süspanse edin. Karanlıkta buz üzerinde 45 dakika kuluçkaya yatırın.
not: İzole edilmiş çekirdeklerin immün boyamasını optimize etmek için, akış sitometrisi analizi ve sıralaması için en uygun seyreltmeyi belirlemek üzere antikorun titre edilmesi önerilir. Ardından, boyama koşullarının optimal olduğunu doğrulamak için yeterli kontrolleri yapın. Örneğin, konjuge anti-NeuN-AF488 antikoru ile, boyanmamış ve lekeli popülasyonların ayrışmasını değerlendirmek için negatif bir kontrol (yani, antikor ilavesi yok, Şekil 2A) ve pozitif bir kontrol (yani, antikorla boyama, Şekil 2B) çalıştırıldı. AF488 konjuge antikor ile çalışmaya başlarken, özgüllüğü değerlendirmek için bir AF488 konjuge izotip kontrolü yapılması önerilir. Konjuge olmayan bir antikor kullanılıyorsa, ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmasını değerlendirmek için sadece bir çekirdek preparatına ikincil bir antikor eklemek gibi ek kontrol gerekli olabilir.
3. Nöronal popülasyonları dışlamak için floresanla aktive edilen çekirdek sıralama (FANS) (Zamanlama: 45 dk)
- İmmüno-lekelenmiş çekirdek süspansiyonunu 5 mL'lik bir test tüpüne aktarın ve akış sitometrisi prosedürünün başlangıcına kadar buz üzerinde tutun.
not: İki fare DG'den daha büyük doku parçalarıyla çalışılıyorsa, çözeltideki çekirdek yoğunluğu yükselirse floresanla aktive edilen hücre sıralayıcısının (FACS) tıkanmasını önlemek için WM tamponu ile daha fazla seyreltme gerekebilir.
- Tüpleri FACS cihazına yerleştirmeden önce numuneleri düşük hızda 3 saniye boyunca vorteksleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: (FACS kurulumu) Ayırma makinelerinin, prosedürün başlangıcında üreticinin tavsiyelerine uygun olarak kalibrasyon parçacıkları ile hizalanması gerekir. Düşme gecikmesi, FACS modeline göre boncuklar veya mikro küreler ile kalibre edildi (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneler saflık modunda 4 °C'de sınıflandırıldı. Toplama hacmini azaltmak için, çekirdekler, akış sitometresi için önerilen basınçta 70 μm'lik bir nozuldan ayrıldı. Çekirdekler, 50 μL WM içeren 1.5 mL'lik düşük bağlayıcı tüplere (Malzeme Tablosuna bakınız) ayrıldı. Tüm toplama tüpleri, çekirdeğin tüpün duvarlarına yapışma riskini azaltmak için gece boyunca 4 ° C'de PBS +% 5 sığır serum albümini (BSA) ile kaplandı.
- Lekeli çekirdek süspansiyonunun bir örneğinden veri elde etmek için, hücre kalıntılarını ve toplanmış çekirdekleri dışlamak için kapıları DAPI yüksekliğine ve DAPI alanına ayarlayın (Şekil 3A). Ayrıca, kapıları kütük tarafı saçılma (SSC) alanına ve kütük ileri saçılma (FSC) alanına ayarlayarak kalan DAPI lekeli agregalardan veya hücre kalıntılarından tek çekirdekleri ayırın (Şekil 3B).
- Şekil 3C'de gösterildiği gibi NeuN-AF488-negatif popülasyonu izole etmek için anti-NeuN-AF488 ve FSC alanı için kapıları ayarlayın.
- Analizden sonra, yukarıda açıklanan geçit stratejisini kullanarak, NeuN-AF488-negatif popülasyonu 50 μL WM.
ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir toplama tüpünde sıralayın
not: Yukarıda açıklanan geçit stratejisini ve DG'yi yetişkin bir farenin beyninden izole etmek için diseksiyon prosedürünü takiben, NeuN-AF488-negatif popülasyonun tek çekirdeğin ~% 14'ünü temsil etmesi beklenmektedir.
Tablo 1: Çalışmada kullanılan ortam ve tamponların bileşimleri.
| >Çekirdek izolasyon ortamı #1 (NIM1) – 4 °C'de 6 aya kadar saklayın |
| parça | Hacim (μL) | Nihai konsantrasyon (mM) |
| 1,5 m sükroz | 1.833,30 | 250 |
| 1 milyon KCl | 275 | 25 |
| 1 M MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 M Tris tamponu, pH 8.0 | 110 | 10 |
| Nükleaz içermeyen su | 8.726,70 | - |
| Toplam hacim | 11.000 | - |
| >Çekirdek izolasyon ortamı #2 (NIM2) – taze yapın |
| parça | Hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| NIM1 | 10.769 | - |
| 1 mM DTT | 11 | 1 μM |
| 100x Proteaz inhibitörü | 110 | 1 katı |
| Triton X-100 %10 (h/d) | 110 | %0,1 (h/h) |
| Toplam hacim | 11.000 | - |
| Homojenizasyon tamponu (HB) – taze yapın |
| parça | Hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| NIM2 | 10.958,75 | - |
| RNaz İnhibitörü, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | Saat 13,75 | 50 U mL-1 |
| Toplam hacim | 11.000 | - |
| Yıkama Ortamı (WM) |
| parça | Hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| BSA %7,5 | 1.466,70 | %1 |
| RNaz İnhibitörü, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | Saat 13,75 | 50 U mL-1 |
| Pbs | 9.492,05 | - |
| Toplam hacim | 11.000 | - |
