$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Malzemeler
- Protokole başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Fosfat tamponlu saline (PBS) fetal sığır serumu (FBS,% 2) ekleyerek yükleme tamponunu hazırlayın.
- PBS'ye nötr kırmızı (NR) boya (son %1) ekleyin.
- Piyasada bulunan Yetişkin Beyin Ayrışma Kitini kullanarak aşağıdaki çözümleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Enzim karışımı 1'i hazırlamak için, 1.9 mL Tampon Z ve 50 μL Enzim P'yi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin.
- Enzim karışımı 2'yi hazırlamak için, 20 μL Tampon Y ve 10 μL Enzim A'yı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
- Kalıntı temizleme solüsyonunu hazırlayın.
2. Fare perfüzyonu ve diseksiyonu
- İntraperitoral olarak (i.p.) fareye anesteziden 2-3 saat önce PBS'de 500 μL %1 NR boyası enjekte edin.
not: Demiyelinizan fare modellerinde intraperitoneal NR enjeksiyonu lezyonların ayırt edilmesine yardımcı olur (Şekil 1).
- Fareyi pentobarbital (50 mg / kg, ip) ile uyuşturun ve ağrı tepkilerini inceleyerek farenin başarılı bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
- Farenin göğüs boşluğunu açın ve kalbi açığa çıkarın.
- Sağ atriyumun küçük bir köşesini dikkatlice kesin ve fareyi sol ventrikülden 20-30 mL soğuk PBS ile intrakardiyal olarak perfüze edin.
- Anestezi altında farenin başını kesin.
- Farenin kafatasını açın ve beyni dikkatlice kafatasından kurtarın.
- Beyni fare beyin dilimi kalıbına aktarın ve beyni 0,1 cm'lik dilimler halinde kesin.
- Beyin dilimlerini çıkarın ve bir Petri kabında (60/15 mm) soğuk PBS'ye koyun. Mikrocerrahi forseps kullanarak, NR boya ile işaretlenmiş lezyonları stereomikroskop altında korpus kallozum etrafında mikrodiseke edin.
not: Sonraki transferi kolaylaştırmak için diseke edilen dokunun mümkün olduğunca eksiksiz olduğundan emin olun; Toplam diseksiyon ilerlemesi 2 saat içinde tamamlanmalıdır.
- Diseke edilen dokuyu uygun miktarda soğuk yükleme tamponu içeren 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.
not: 2-3 fareden alınan korpus kallozum dokusunu tek bir tüpte tek bir numune olarak bir araya getirin.
3. Doku ayrışması
- Numuneyi tüpün dibinde toplamak için diseke edilen dokuyu 30 × g'da 30 saniye boyunca (bu hıza ulaştıktan sonra) santrifüjleyin.
- Bir inkübatörde 1 ve 2 ila 37 °C enzim karışımını önceden ısıtın.
- Bir numuneye 1.950 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 ekleyin ve 37 °C'de bir inkübatörde 5 dakika sindirin.
- 30 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 2 ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- 37 °C'de bir inkübatörde 15 dakika sindirin ve her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
- Sindirimden sonra tüpe 4 mL soğuk PBS ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
- 70 μm'lik filtreleri 50 mL'lik santrifüj tüplerine yerleştirin ve filtreleri 500 μL soğuk PBS ile önceden ıslatın. Sindirilmiş doku örneklerini filtrelerden geçirerek ayrışmış dokuyu süzün ve 50 mL'lik santrifüj tüpündeki filtrelenmiş süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
not: Doku miktarı çok küçükse bu adımı atlayın.
- Filtrelenmiş doku örneklerini 300 ×g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı yavaş ve tamamen aspire edin.
not: Enzimatik sindirim dışındaki tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
4. Enkaz kaldırma
- Hücre peletini 1.550 μL soğuk PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin.
- Kalıntıların giderilmesi için 450 μL soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
- Yukarıdaki karışımı 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 2 x 1 mL soğuk PBS ile yavaşça ve nazikçe kaplayın.
not: Santrifüj tüpünü 45 ° eğin ve pipetle tüp duvarı boyunca yavaşça PBS ekleyin.
- Tüpü yavaş ve nazikçe bir santrifüje aktarın ve 10 dakika boyunca 4 ° C ve 3.000 × g'da döndürün.
- Santrifüjlemeden sonra üç katman arayın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak üst iki katmanı tamamen aspire edin (Şekil 2).
- Tüpü 5 mL'ye kadar soğuk yükleme tamponu ile doldurun ve tüpü üç kez yavaşça ters çevirin.
- 4 ° C'de ve 1.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletini bozmaktan kaçının.
>5. Mikroglial hücrelerin manyetik olarak ayrılması
- Hücre peletini 90 μL yükleme tamponu ile yeniden süspanse edin ve 10 μL CD11b (Microglia) boncukları ekleyin.
- İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve inkübe ettikten sonra hücreleri yıkamak için sıvıyı 1.000 μL'lik bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C ve 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatanı tamamen aspire edin.
- Hücreleri 500 μL yükleme tamponunda yeniden süspanse edin.
- Manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.
- Hücreleri korumak ve üreticinin protokolünü izleyerek manyetik ayırmanın verimliliğini sağlamak için sütunu 500 μL yükleme tamponu ile durulayın.
- Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı atın.
- Kolon duvarına yapışan hücreleri yıkamak ve akışı atmak için kolona üç kez 500 μL yükleme tamponu ekleyin.
not: Yalnızca kolon rezervuarı boşken yıkama için yeni bir yükleme tamponu ekleyin.
- Kolonu yıkadıktan sonra kolonu separatörden çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Kolona 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu dibe doğru itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tamamen toplamak için bu adımı üç kez tekrarlayın.
