Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çözelti Hazırlama
- NGM-Agar plakaları (1 L)
- 3 g NaCl, 2.5 g pepton ortamı (örneğin, Bacto-Peptone) ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL kolesterol (% 95 etanol [EtOH] stoğunda 5 mg / mL), 1 mL 1 M MgS04, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2 PO4 ve 1 mL amfoterisin B (2.5 mg / mL stok).
- NGM-Agar RNAi plakaları (1 L)
- 3 g NaCl, 2.5 g pepton ortamı ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL kolesterol (%95 EtOH stogunda 5 mg/mL), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL amfoterisin B (2.5 mg / mL stok), 1 mL 1 M izopropil β- d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve 1 mL karbenikilin (50 mg / mL).
- Luria-Bertani (LB)-Agar (1 L)
- 10 g pepton ortamı, 5 g maya özütü, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. H2O'yu 1 L'ye ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL 50 mg/mL karbenisilin ve 2.5 mL 5 mg/mL tetrasiklin ekleyin.
- LB Orta (1 L)
- 10 g pepton ortamı, 5 g maya özütü, 5 g NaCl ve 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. H2O'yu 1 L'ye ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL 50 mg / mL karbenisilin ekleyin.
- M9 tampon (1 L)
- 6.0 g Na2HPO4, 3 g K2PO4, 5 g NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Kullanmadan önce 1 mL 1 MMgS04 ekleyin.
- Ağartma solüsyonu (10 mL)
- 1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O'yu 10 mL'ye ekleyin.
2. RNAi Plakalarının Hazırlanması
Not: C. elegans tipik olarak laboratuvarda 7,5 mL Nematod Büyüme Ortamı Agar (NGM-Agar) içeren 6 cm'lik Petri plakaları üzerinde kültürlenir. Bu protokol, 15 °C'de tutulan solucanlar için optimize edilmiştir. NGM'li plaklar hazırlamak için, mantar ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için standart steril teknikler kullanın. Aşağıdakiler, RNAi için reaktiflerle desteklenmiş NGM plakalarını hazırlama protokolüdür.
- 1 mM IPTG ve 50 μg/mL karbenisilin içeren 6 cm'lik NGM-Agar RNAi plakaları hazırlayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 24 – 48 saat kurumaya bırakın.
- RNAi plakalarını karanlıkta 4 °C'de tutun. 14 günden daha eski ise kullanmayın.
- 50 μg/mL karbenisilin ve 12.5 μg/mL tetrasiklin içeren LB-agar plakaları üzerinde mevcut RNAi kütüphanesinden13 donmuş gliserol stoğundan lin-53 gen DNA dizisi ile L4440 plazmidini içeren RNAi bakterisi (Escherichia coli HT115) klonunu üç fazlı çizgi deseni kullanarak seçin. Bakterileri gece boyunca 37 °C'de büyütün. Bu klon, bakterilerde IPTG'ye bağlı lin-53 dsRNA üretimine izin verir.
- Ek olarak, boş vektör kontrolü olarak herhangi bir gen dizisi olmadan L4440 plazmidini içeren RNAi bakterilerini büyütün.
- Ertesi gün, 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak lin-53 veya boş vektör LB-agar plakalarından tek bir koloni seçin ve her birini 50 μg/mL karbenisilin ile desteklenmiş 2 mL sıvı LB ortamı içeren ayrı bir kültür tüpüne aşılayın. Kültürleri, 600 nm'de 0,6 – 0,8 optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar 37 ° C'de gece boyunca büyütün. OD'yi bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
DİKKAT: Sıvı LB ortamı, bakterileri gliserol stoğundan ayırmak için kullanılan LB-agar plakasının aksine tetrasiklin içermemelidir, çünkü besleme sırasında tetrasiklin dahil edilmesi RNAi verimliliğinin azalmasına neden olur.
- Bir multipipet kullanarak 6 cm NGM-Agar RNAi plakalarına her bakteri kültüründen (lin-53 veya boş vektör) 500 μL ekleyin. Plakaları kapalı bir kapakla gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuruması için inkübe edin. Bu süre zarfında, NGM plakalarındaki IPTG, bakterilerde dsRNA üretimini indükleyecektir.
- Deney başına bakteri kültürü başına en az 3 plaka kullanın. Bu, her deney için 3 teknik kopya sağlayacaktır.
- Kurutulmuş NGM-agar RNAi plakalarını bakteri ile karanlıkta 4 °C'de iki haftaya kadar saklayın.
3. C. elegans Suşu BAT28'in Hazırlanması
- OTIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] transgenlerini içeren BAT288 solucan suşunu OP50 bakterileri üzerinde 15 °C.
'de standart NGM-Agar plakaları kullanarak koruyun
Not: Nematod kültürü ile ilgili ayrıntılı protokol için bkz. Rol-6 (su1006) baskın bir aleldir ve tipik yuvarlanma hareketine neden olan yaygın olarak kullanılan fenotipik enjeksiyon belirtecidir16. otIs305 transgeninde hsp-16.2prom::che-1'i izlemek için kullanılır.
- hsp-16.2prom::che-1 transgeninin erken aktivasyonunu önlemek için BAT28 suşunu her zaman 15 °C'de tutun. Suşu mümkün olduğunca ele alırken 15 °C'den daha yüksek sıcaklıklara maruz kalmayı azaltın.
- Solucanları yaşla senkronize etmek için ağartma tekniğini kullanın.
- BAT28'in yetişkinlerini ve yumurtalarını içeren 6 cm'lik NGM-Agar plakalarını 900 μL M9 tampon kullanarak yıkayın. 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüj ederek pelet kurtları. Süpernatanı çıkarın.
- 0,5 – 1 mL ağartma solüsyonu ekleyin ve yetişkin solucanlar açılmaya başlayana kadar tüpü yaklaşık 1 dakika çalkalayın. Standart bir stereomikroskop kullanarak izleyin.
- Pelet kurtları 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüj ederek. Süpernatanı çıkarın.
- Solucan peletini 800 μL M9 tamponu ekleyerek ve 900 x g'da santrifüjleyerek 3 kez yıkayın.
- Temizlenmiş yumurtaları OP50 bakterisi ile tohumlanmış taze NGM plakalarına yerleştirin. OP50 bakterileri üzerinde 15 ° C'de L4 aşamasına ulaşana kadar (yaklaşık 4 gün) ağartılmış bir popülasyon oluşturun. L4 larvaları, standart bir stereomikroskop kullanılarak solucanın ventral tarafının yaklaşık yarısına kadar beyaz bir yama ile tanınabilir18.
not: Lin-53'ün tükenmesi üzerine germ hücresinden nörona dönüşüm fenotipini elde etmek için, ebeveyn neslinde (P0) tükenmesi gerekir. Dönüşüm fenotipi için puanlama bir sonraki nesilde (filial nesil F1) yapılır. Zaten P0'da bulunan tükenmiş lin-53'ü elde etmek için, L4 hayvanları RNAi'ye tabi tutulur.
- Bir platin tel kullanarak replike başına 50 L4 aşama solucanını herhangi bir bakteri içermeyen bir NGM plakasına manuel olarak aktarın ve solucanların aktarılan herhangi bir OP50 bakterisinden uzaklaşmasına izin verin. Solucanların plaka üzerinde yaklaşık 5 dakika hareket etmesine izin verin. İlgili RNAi plakalarına aktarmak için daha önce lin-53 RNAi bakterileri (veya boş vektör kontrolü) ile tohumlanmış NGM-Agar RNAi plakalarından bakterileri kullanın.
- OP50 bakterilerini gerçek RNAi plakalarına aktarmaktan kaçının. Gerginliğin 15 °C'den daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için hızlı çalışın.
- Solucanları NGM-Agar RNAi plakaları üzerinde 15 °C'de yaklaşık 7 gün boyunca solucanların F1 dölleri L3 – L4 aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. F1 döllerinden daha büyük ve daha kalın oldukları için P0 hayvanlarından net bir şekilde ayrılabilirler.
- F1 döl solucanlarının Şekil 1'de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini gösterip göstermediğini standart bir stereomikroskop altında görsel olarak kontrol edin. Lin-53'e karşı RNAi, pleiotropik etkilere sahiptir ve lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilecek pvul fenotipine neden olur.
not: Lin-53'e karşı RNAi ayrıca F1 embriyolarının ölümcüllüğüne neden olabilir. Bu etki, hayvanlar L3 – L4 aşamasına ulaşmadan önce plakalar 15 °C'den daha yüksek derecelere maruz kalırsa artar. Ölü embriyolar, gelişimin durması ve kuluçka eksikliği ile tanınabilir.
- IPTG ışığa duyarlı olduğu için plakaları karanlıkta inkübe edin.
4. Germ Hücresinin Yeniden Programlanmasının İndüksiyonu
- CHE-1'i aktive etmek için lin-53 ve boş vektör RNAi ile muamele edilmiş F1 dölünü içeren RNAi plakalarını karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha verimli bir ısı şoku sağladığı için havalandırmalı bir inkübatör kullanın.
- Isı şoku ile şoklanmış hayvanların karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika iyileşmesine izin verin ve ardından plakaları karanlıkta gece boyunca 25 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Bir floresan ışık kaynağına bağlı standart bir stereomikroskop kullanarak, Şekil 2'de gösterildiği gibi solucanların orta vücut bölgesindeki gcy-5prom::gfp'den türetilmiş sinyaller için yeşil floresan protein (GFP) filtresi altındaki hayvanları inceleyin. GFP sinyalleri için mikroskobu ayarlayın: maksimum 488 nm'de uyarma ve maksimum 509 nm'de emisyon
.
- GFP sinyalli hayvanları agar pedi içeren mikroskopi slaytları üzerine orta vücut bölgesine monte ederek germ hücresinin nörona dönüşüm derecesini değerlendirin.
- Fenotip penetrasyonunu değerlendirmek için germ hücresinin nörona dönüşümünü gösteren hayvanların sayısını ve karanlık hayvanları sayın. Tipik olarak, hayvanların yaklaşık% 30'u, lin-53 tükenmesi üzerine germ hattında ayrı GFP sinyalleri gösterirken, hayvanların% 5'inden fazlası, boş vektör RNAi üzerine germ hattında yaygın GFP sinyalleri göstermez.
