>Yasal Uyarı: Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Beyin ve omuriliğin mekanik homojenizasyonu
NOT: Bu bölümde anlatılan hacimler, beynin veya omuriliğin yarısının homojenizasyonu için yeterlidir.
- Buz üzerine yerleştirilmiş Dounce doku öğütücünün (Malzeme Tablosu) cam harcını önceden soğutun.
- Harca 3 mL önceden soğutulmuş 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin.
- Dokuyu (beyin veya omurilik) 6 oyuklu plakanın kuyusundan cam harcın içine aktarın, 1x HBSS'ye batırıldığından ve harcın dibine oturduğundan emin olun.
- Dokuyu 10 vuruş havaneli A ve ardından 10 vuruş havaneli B ile nazikçe parçalayın. Homojenize karışımı 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
- Önceden soğutulmuş 1x HBSS kullanarak tüpü 10 mL'lik nihai hacme kadar doldurun ve 4 ° C'de 320 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve her tüpe 7 mL'lik son hacme kadar buz gibi soğuk 1x HBSS ekleyin ve peleti girdap yaparak nazikçe yeniden süspanse edin.
2. Enkaz kaldırma
>NOT: Esas olarak sindirilmemiş doku ve miyelin kılıflarından oluşan döküntülerin uzaklaştırılması, sonraki akış sitometrik analizleri için doku homojenatının verimli bir şekilde boyanmasını sağlamak için kritik bir adımdır.
- Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için her numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Bu adım, omurilik dokularıyla çalışırken özellikle önemlidir, çünkü bu örneklerin sonraki adımları etkileyebilecek sindirilmemiş sinir parçaları veya meninksler içerme olasılığı daha yüksektir.
- Her numune tüpünde son hacmin 7 mL olduğundan emin olun. Değilse, 7 mL'ye kadar buz gibi soğuk 1x HBSS ile doldurun.
- %30'luk bir nihai konsantrasyonda yoğunluk gradyan ortamı içeren bir çözeltinin 10 mL'lik bir nihai hacmini yapmak için her numuneye 3 mL önceden soğutulmuş izotonik Percoll çözeltisi (IPS) ekleyin. Homojen bir şekilde karıştıklarından emin olmak için numuneleri nazikçe vorteksleyin.
- Numuneleri 18 °C'de 700 x g'de 15 dakika santrifüjleyin, santrifüjün ivmesini 7'ye ve freni 0,
'ye ayarladığınızdan emin olun
not: Santrifüjleme yaklaşık 30 dakika sürmelidir.
- Numuneleri santrifüjden hassas bir şekilde çıkarın.
not: Enkaz ve miyelden oluşan beyazımsı bir disk, çözeltinin yüzeyinde yüzen görünür olmalıdır. Tüpün dibinde bir pelet (ilgilenilen hücreleri içeren) görünür olmalıdır.
- Tüm beyazımsı döküntü diskini ve ardından süpernatantın geri kalanını dikkatlice aspire edin ve peleti yerinden çıkarmadığınızdan emin olun. Yanlışlıkla yerinden çıkma riskini önlemek için hücre peletinin üzerine yaklaşık 100 μL çözelti bırakın.
- 1 mL akış sitometrisi (FACS) bloke edici (BL) solüsyonu ekleyin, 1000 μL'lik bir pipet ucuyla yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin ve numuneleri 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
- Oda sıcaklığında (RT) 450 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti, sonraki analizlerle uyumlu uygun tamponda yeniden süspanse
edin
