$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Malzemelerin hazırlanması
- Manyetik ile aktive edilen hücre sıralama (MACS) tamponu: PBS-/-'de 2 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) (Malzeme Tablosu) hazırlayın.
- Kollajenaz IV stok çözeltisi (20 U/μL): Tozu PBS+/+ (Malzeme Tablosu), alikot içinde yeniden süspanse edin ve -20 °C'de saklayın.
not: Kollajenaz IV, MgCl2'nin tamamen aktif olmasını gerektirir; Kollajenaz IV çözeltisini dondurmayın-çözmeyin.
- Anestezik-analjezik çözelti: 150 μL ketamin (150 mg / kg), 25 μl ksilazin (5 mg / kg) ve 330 μl buprecare (0.1 mg / kg) 1 mL PBS- / -.
karıştırın
not: Anestezik-analjezik solüsyonu doğaçlama olarak hazırlayın ve bir günden fazla tutmayın.
- Heparin çözeltisi (100 U / mL): Tozu PBS-/- içinde yeniden süspanse edin.
- PBS-/- ile doldurulmuş bir dekantör Erlenmeyer'e bir tüp bağlayarak infüzyon iç sistemini hazırlayın. İnfüzyon tüpünün ekstremitesine 23 G'lik bir iğne bağlayın. İnfüzyon ekini açın ve tüpte kabarcık kalmayana kadar PBS'nin çalışmasına izin verin.
- Bir ışıkla donatılmış dürbünü hazırlayın.
2. C57BL/6 farelerin muhafazası
- CP (koroid pleksuslar) miyeloid veya T hücrelerinin analizi için, her biri için dört fare kullanın ve dört CP'yi toplayın (her lateral ventrikülden iki, üçüncü ventrikül ve dördüncü ventrikül CP; toplamda sekiz fare için). SP'nin havuzlanmaması, düşük bollukları nedeniyle SP'deki nadir immün popülasyonları tespit edememe riskini taşır.
- Herhangi bir deneyden önce farelerin en az 7 gün iklime alışmasına izin verin. Fareleri patojen içermeyen koşullar altında, sabit sıcaklık ve nemde, 12/12 saat veya 14/10 saat aydınlık/karanlık döngüsünde, su ve standart pelet yem ad libitum ile tutun.
3. PBS perfüzyonu ve beyin diseksiyonu
- Her fareyi tartın ve intraperitoneal olarak 10 μL / g anestezik-analjezik karışım solüsyonu (adım 1.3) enjekte edin.
- Etkili analjezi için yaklaşık 30 dakika bekleyin (farenin parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin).
- Anestezi uygulanmış fareyi diseksiyon desteğinin üzerine sırt üstü düz bir şekilde yerleştirin ve avuç içlerini diseksiyon desteğine bantlayın.
- Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırarak ve makas kullanarak, kalbi ortaya çıkarmak için karnı, diyaframı ve göğüs kafesini açın.
not: Göğüs kafesi açıldığında beyin anoksik hale gelir. Perfüzyonun sonraki adımlarında kesin ve hızlı bir şekilde ilerlemek gerekir.
- 20 μL 100 U/mL heparin solüsyonunu doğrudan sol ventriküle enjekte edin.
- İnce makasla, kanın vücuttan dışarı akmasını sağlamak için sağ kulakçıkta en az 3 mm'lik bir kesi yapın.
- Hemen ardından, infüzyon tüpünün ucuna yerleştirilen 23 G iğnesini sol ventrikülün ucundan geçirin.
- İnfüzyon sistemini maksimumda açın ve tam perfüzyonu bekleyin: Yaklaşık 6 mL / dk akış hızında 23 G'lik bir iğne kullanarak, perfüzyon 3 dk.
içinde tamamlanır
not: Karaciğer gibi organların eşit renk değişikliği, perfüzyon etkinliğini kanıtlar.
- İnfüzyon sistemini kapatın ve iğneyi kalp ventrikülünden çıkarın.
- Bandı farenin avuçlarından çıkarın. Fareyi ventral pozisyona getirin.
- Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırarak ve makas kullanarak, cildi başın üstünden, gözlerden kulaklara kadar çıkarın.
- Makas yardımıyla kafatasını önce gözlerin arasından, sonra her bir gözden omuriliğe doğru masseter kaslarının hemen üzerinden yanal olarak kesin. Bunun için makasın uç kısmını kullanın ve makasla beyne zarar vermemek için nazikçe ilerleyin.
- Kafatasını forseps ile gözler arasındaki ekstremiteden sıkıştırarak açın.
- Omuriliği kesmek için makas kullanın ve beyni forseps ile çıkarın, iki noktasını beynin yan tarafına yerleştirerek eğin ve buz gibi PBS+/+ ile dolu bir Petri kabına yerleştirin. CP'ler daha sonra hemen toplanır.
not: Perfüzyon etkinliğini doğrulamak için beyinde renk değişikliği olup olmadığını kontrol edin.
4. Koroid Pleksusun beyinden diseksiyonu
- Beynin sırt tarafını Petri kabına ve binoküler lupların hedeflerinin altına yerleştirin.
- Beyni yerinde tutmak için forseps yardımıyla, başka bir forsepsin iki ucunu yarım küreler arasındaki orta hattan aşağı doğru sokun.
- Kalozum ve hipokampus ile korteksi septumdan uzaklaştırmak için forseps kullanın, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarın.
- Lateral CP'yi, her iki ucunda genişleyen lateral ventrikülü kaplayan uzun bir örtü olarak tanımlayın. Lateral CP'yi yakalamak için ince bir forsepsin iki ucunu kullanın. Hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenmiş olabilecek üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin.
- Tüm üçüncü ventrikülü ve karşı lateral ventrikülü ortaya çıkarmak için kontralateral hemisferin korteksi, korpus kallozumunu ve hipokampusunu septumdan uzaklaştırın.
- Üçüncü CP'yi, tanecikli bir yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanabilen ince forseps ile toplayın.
- Diğer yanal CP'yi toplayın.
- Bir forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına sokun. Dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın.
- Dördüncü CP'yi, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan serebellum ve medulla arasındaki sol uca kadar kaplayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun küresel bir yapı olarak tanımlayın. Dördüncü CP'yi ince forseps ile toplayın.
not: Forsepslerin silan bazlı kaplaması, CP'nin forseps üzerine yapışmasını önleyebilir.
- Diğer yedi farenin her biri için 3.1-4.9 adımlarını tekrarlayın. Bu esnada toplanan SP buz üzerine yerleştirilen bir tüp içerisinde geçici olarak bekletilebilir.
5. Akış sitometrisi analizi için numunelerin hazırlanması
- Tüm diseke CP'yi içeren tüpü 750 μL PBS +/+.
not: Tüpte ince forseps ile diseke CP'nin birikmesi, küçük bir hacim PBS + / + üretir. CP dokusunun olası bir kaybını önlemek için, mevcut hacmi 750 μL'ye tamamlamak, onu çıkarıp taze 750 μL PBS+/+ ile değiştirmekten daha iyidir.
- 400 U/mL'lik bir nihai konsantrasyon için 15 μL 20 U/μL Kollajenaz IV stok çözeltisi ekleyin (bkz. adım 1.2)
not: DNAse I (150 μg/mL) aşırı hücre topaklanmasını önleyebilir.
- CP'yi Kollajenaz IV ile 37 ° C'de hafif çalkalama (300 RPM) altında 45 dakika inkübe edin.
- CP ayrışmasını sonlandırmak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için CP tüpünü MACS tamponu ile 1,5 mL'ye kadar doldurun (tarif adımı 1.1'e bakın).
not: Kollajenaz IV aktivitesi düşük sıcaklıklarda durdurulur ve serum albümini tarafından inhibe edilir.
- Hücreleri 500 x g'da, 5 dakika, 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1.5 mL MACS tamponu ile yıkayın.
- Hücreleri 500 x g'da 5 dakika, 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 220 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.