Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Özet

Kaynak: Sarkar, S. et al., Gelişmiş Saflık ve Çok Yönlülük ile Primer Mikroglia'nın Hızlı ve Rafine CD11b Manyetik İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Karışık Glial Kültürlerin Yetiştirilmesi

1. 1-2 günlük yavruları 5,5 inçlik çalıştırma makasıyla hızlı bir şekilde kesin ve kafaları hemen buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bu kafa kesmenin ötenazi modu olduğunu unutmayın.
2. Laminer hava akımı başlığında, 4,5 inç düz mikro diseksiyon makası kullanarak kafatasında ve meninkslerde küçük bir kesi yapın. Kaudal uçtan rostral uca (burun) kesmeye başlayın. Kafa kesilmesi ile oluşan açıklığı kullanarak derinin altına girin.
   1. Kesiden sonra, yarım kürelerden birini yana doğru soyun. Ardından tüm beyni çıkarmak için bir çift kavisli veya kancalı cımbız kullanın.
3. Beyin(ler)i 37 °C su banyosunda 15 dakika boyunca %0,25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 50 mL'lik yeni bir tüpe daldırın. Beyin başına 2 mL tripsin-EDTA kullanın.
4. Beyin(ler)i taze büyüme ortamı ile yıkayın (% 10 fetal sığır serumu (FBS), Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı / Besin karışımı F12 (DMEM / F12),% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 sodyum piruvat ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler) ortamı ekleyip çıkararak. Bu 4x'i tekrarlayın.
5. Her beyin için, büyüme ortamı içeren iki T-75 şişesi yerleştirin. Bu nedenle, tüpe beyin başına 2 mL büyüme ortamı ekleyin. Böylece, T-75 şişesi başına 8-9 mL büyüme ortamı ile 1 mL homojenize beyne eşdeğer olacaktır.
6. Beyin(ler)i en büyükten en küçüğe doğru farklı açıklık boyutlarına sahip pipetlerle ezerek homojenize edin. Beyin dokusunun küçülmediği görüldüğünde, bir sonraki pipete geçin. Öğütme işleminin sonunda, süspansiyon görünür parçalar olmadan net olmalıdır.
   1. Sırayla 25 mL'lik bir pipet, 5 mL'lik bir pipet ve ardından 10 mL'lik bir pipet kullanın.
7. Her homojen beyin süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek tek bir hücre kültürü haline getirin.
8. Her homojenize beyin için, adım 1.5'te tarif edildiği gibi büyüme ortamı içeren iki T-75 şişesi yerleştirin (T-75 şişesi başına 8-9 mL büyüme ortamı ile 1 mL homojenleştirilmiş beyin).
9. Büyüme ortamını 6 gün sonra değiştirin ve 16. günde izolasyona kadar büyütün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Yaşam Teknolojileri	11330057
Sodyum Pirüvat	Yaşam Teknolojileri	11360070
MEM Esansiyel olmayan amino asitler (100x)	Yaşam Teknolojileri	11140050
L-Glutamin (100x)	Yaşam Teknolojileri	25030081
Edta	Balıkçı Bilimsel	AM9260G
Fetal Sığır Serumu	Sigma	13H469
% 0.25 Tripsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200

Serisi adet