1. Mikroglia farklılaşması
NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.
- İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kültürü
not: iPSC kültür tekniklerini açıklayan daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir.
- Çözdürme ve bakım
- iPSC ortamını hazırlayın, ayırın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın. Alikotları gece boyunca 4 °C'de çözdürün ve 1 haftaya kadar kullanın. Kullanmadan önce ortamı en az 1 saat ortam sıcaklığında bırakın.
- Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum içeren fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde seyreltilmiş 1 mL 10 μg / mL laminin 521 ekleyerek 6 oyuklu bir plakanın kuyularını kaplayın. Plakaları en az 2 saat veya tercihen gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde tutun. Seyreltildikten sonra laminini 3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Steril suda seyrelterek 10 mM Rho kinaz inhibitörü Y27632 (ROCK İnhibitörü) stok çözeltisini hazırlayın. ROCK inhibitör solüsyonunun tek kullanımlık kısımlarını yapın ve bunları -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın.
- DPBS'de 0.5 M EDTA'nın stok çözeltisini seyrelterek 0.5 mM Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) hazırlayın.
- Dondurulmuş iPSC'lerden oluşan bir şişeyi çözmek için, şişeyi çoğunlukla çözülene kadar 37 °C'de bir su banyosuna koyun. Şişenin içeriğini hemen 4 mL iPSC ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve kolonileri rahatsız etmemek için tüpün duvarına 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL iPSC ortamını yavaşça ekleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
- Kaplanmış oyukların her birine 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1,5 mL iPSC ortamı ekleyin ve yeniden süspanse edilen kolonileri damla damla besiyerini içeren kuyucuklara aktarın.
not: Kültür bakımı için 1.1.1.6 adımından 5-7 damla kullanın, ancak her iPSC hattı için en uygun tohumlama yoğunluğunu ayarlayın.
- Plakayı manuel olarak yan yana ve arkadan öne karıştırarak hücreleri kuyucuklara eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü içermeyen taze iPSC ortamı ekleyerek ortamı tamamen değiştirin.
- Bakım için, hücreler %80 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
not: Kullanılan iPSC ortamı esnek bir besleme programına izin veriyorsa, hücreler ortamı değiştirmeden 2 gün boyunca korunabilir. Bunun geçiş başına bir kez ile sınırlandırılması ve yalnızca hücrelerin %50'den az birleştiği durumlarda sınırlandırılması tavsiye edilir.
- Bölme
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
- Hücreleri yerinden çıkarmak için 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarları kuyu yüzeyinden kalkana kadar oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Hücreleri tekrar DPBS ile yıkayın ve 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
- Hücre kolonilerini bir hücre kaldırıcı kullanarak nazikçe kazıyarak ayırın. Kolonileri rahatsız etmemek için kuyunun her alanını yalnızca bir kez kazıyın.
not: Kolonileri kuyudan çıkarmak için alternatif yöntemler başka yerlerde bulunabilir.
- 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, hücreleri toplayın ve 1:6 oranında (hücrelerden ortaya) damla damla 1.5 mL iPSC ortamı içeren önceden kaplanmış oyuklara (adım 1.1.1.2'de belirtildiği gibi) aktarın.
2. Mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) iPSC farklılaşması
NOT: Küçük moleküller ve büyüme faktörleri, DPBS'de steril filtrelenmiş %0.1 sığır serum albümini içinde nihai konsantrasyondan 1.000 kat daha yüksek bir stok konsantrasyonuna kadar çözülür. Erken geçişler sırasında iPSC'leri iMG'lere ayırmanız önerilir. iPSC hatlarının rutin karyotiplendirilmesi tavsiye edilir.
- Standart kaplama çözeltisi hazırlayın
- Hücre dışı bir matris kaplama reaktifinin stok çözeltisini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözdürün.
- Mikrosantrifüj tüplerini ve filtre pipet uçlarını 4 °C'de soğutun.
- Her bir tüpe 250 μL konsantre hücre dışı matris kaplama reaktifi ekleyin ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Alikotları -20 °C'de saklayın.
- Kaplama çözeltisini hazırlamak için, hücre dışı matris kaplama reaktifi alikotlarından birini gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözün.
- İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (DMEM-F12 olarak anılır) büyümesi için optimize edilmiş 50 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Nutrient karışımı F12 (DMEM-F12) ortamını önceden soğutulmuş bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde tutun.
- Buz gibi DMEM-F12'yi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL'lik bir pipet ucunu soğutun ve ardından 250 μL hücre dışı matris kaplama reaktifini DMEM-F12 ortamını içeren konik tüpe aktarmak için hemen pipet ucunu kullanın.
not: Standart kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta boyunca saklanabilir.
- Embriyoid cisim (EB) oluşumu
- 4 ° C'de 4 güne kadar muhafaza edilebilen EB ortamı hazırlayın.
- iPSC'ler %80 birleşmeye ulaştığında, 1 mL DPBS ile yıkayarak ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca 1 mL ayrışma reaktifi ekleyerek kolonileri ayırın. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için birden çok kez kazıyarak bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri yerinden çıkarın. Hücreleri toplayın ve her şeyi 9 mL DPBS içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL EB ortamında yeniden süspanse edin. 10 μL hücre alın ve 1: 1 oranında Tripan mavisi ile seyreltin. Hücreleri bir hematitometre ile sayın ve hücre sayımına bağlı olarak, hücre stoğunu 100 μL'de 10.000 hücrelik bir son seyreltmeye seyreltin. Hücreleri kaplamak için, düşük yapışmalı, yuvarlak tabanlı, 96 oyuklu bir plakaya oyuk başına 100 μL seyreltilmiş hücre ekleyin.
not: Genel olarak, 96 kuyulu plakanın 48 kuyusu, iPSC'lerin her %80'lik birleşik kuyusundan elde edilebilir.
- Plakayı 125 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 4 gün boyunca inkübe edin. 2. günde çok kanallı bir pipet kullanarak ve 50 μL eski ortamı nazikçe toplayarak ve ardından 50 μL taze EB ortamı ekleyerek yarı-orta bir değişiklik yapın.
not: 4. günde, iPSC'ler, sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi EB'ler olarak adlandırılan küresel hücresel yapılar oluşturacaktır. EB farklılaşma süreci gerekirse 7 güne kadar uzatılabilir.
- İlkel makrofaj öncüllerinin (PMP'ler) üretilmesi
- PMP baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.
- 1 mL buz gibi soğuk Matrigel kaplama çözeltisi ekleyerek 6 oyuklu bir plakanın kuyularını kaplayın ve en az 2 saat veya tercihen gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- EB farklılaşmasının 4. gününde, EB'leri 1 mL pipet uçlarıyla (bir pipet kullanarak) toplayarak EB'leri Matrigel kaplı kuyucuklara aktarın. EB'leri kuyudan çıkarmak için bir veya iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin. EB'lerin kuyunun kenarına yerleşmesini sağlamak için 6 oyuklu plakayı eğimli bir açıyla tutun.
not: Kaplanmış kuyu başına dokuz veya on EB kaplanabilir.
- Tüm EB'ler yerleştikten sonra, EB'leri kuyunun kenarında tutarken 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak eski ortamı nazikçe pipetleyin ve çıkarın. Her kuyucuğa 3 mL taze hazırlanmış PMP tam ortamı ekleyin. Plakayı manuel olarak yan yana ve arkadan öne karıştırarak hücreleri kuyucuklara eşit olarak dağıtın. Plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin.
- EB'lerin kuyu dibine yapışmasına izin vermek için plakayı 7 gün boyunca rahatsız etmeyin. Bu süreden sonra, PMP tam ortamını kullanarak yarı-orta bir değişiklik yapın.
not: Bu noktada, EB'lerin çoğu plakaya takılmalıdır. Yüzen EB'ler kaldırılabilir.
- 5-7 gün sonra, kuyuların dibine takıldıklarından emin olmak için EB'leri 4x büyütmede bir ışık alanı mikroskobu altında inceleyin. Ortamı 1.2.3.5'te açıklandığı gibi değiştirin. 21. günde, 3 mL PMP tam ortam ile tam bir orta < değişikliği gerçekleştirin.br />
not: Ortamda yüzen miyeloid progenitörler bu noktada belirgin olabilir. Ortam değişimi sırasında bu hücreler atılmalıdır.
- 28. günde, süpernatantta PMP olarak adlandırılan yuvarlak hücreleri arayın ve PMP'leri içeren ortamı 10 mL'lik bir pipet ve otomatik pipetleyici kullanarak toplayın. EB'leri rahatsız etmemeye dikkat edin. PMP'leri ve ortamı 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi ilerleyin.
not: Genellikle aynı iPSC hattından gelen PMP'ler, 6 oyuklu bir plakanın beş kuyusundan toplanabilir ve tek bir 15 mL konik tüpte bir araya getirilebilir.
- EB'lerin daha fazla bakımı için 3 mL taze PMP tam ortamı ekleyin. PMP'ler 3 aydan daha uzun bir süre boyunca EB'lerden sürekli olarak ortaya çıktığından, bunları 1.2.3.7 ve 1.2.3.8.
adımlarında açıklandığı gibi her 4-7 günde bir toplayın (ortamın renginin sarı tona dönmesine izin vermeyin)
not: PMP'ler birkaç ay boyunca toplanabilse de, zamanla fenotiplerini değiştirebilirler.
- iMG'lere farklılaşma
- iMG baz ortamını (Malzeme Tablosu) hazırlayın, steril filtreleyin ve 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın.
- PMP'ler 15 mL'lik konik bir tüpe toplandıktan sonra, 4 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 1-2 mL iMG bazal ortam kullanarak PMP'leri yeniden süspanse edin. Küçük bir alikot alarak ve Tripan mavisi ile 1: 1 oranında seyrelterek bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
NOT: iPSC çizgisine × EB kültürünün yaşına bağlı olarak normalde her hafta 0.5-1.5 ila 106 PMP elde edilir.
- Hücrelerin geri kalanını 4 dakika boyunca 200 × g'da tekrar santrifüjleyin. PMP'leri, hücrelerin ~ 105 /cm2 yoğunlukta kaplanması için istenen konsantrasyona seyreltin, taze hazırlanmış iMG tam ortam kullanılarak hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar üzerinde. Terminal farklılaşmasına izin vermek için 10-12 gün boyunca her 3-4 günde bir taze hazırlanmış iMG tam ortam kullanarak yarı-orta bir değişiklik yapın.
not: Bu noktada, hücreler mikroglia benzeri morfoloji kazanmalıdır. PMP'lerin mikroglia kaderine olan bağlılığını doğrulamak için, purinerjik reseptör P2RY12 ve transmembran protein 119 (TMEM119) gibi mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçlerin ekspresyonunu doğrulamak için immünofloresan analizi yapılır.
- Hücre sağlığını ve canlılığını korumak için, tüm deneyleri iMG farklılaşmasının 10 ila 12. günleri arasında gerçekleştirin.
