>Yasal Uyarı: Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Retina ayrışması
NOT: Aşağıdaki tüm adımların (hücre hasadına kadar) bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir.
- Papain/DNase I ayrışma karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın.
- Altı retina için, 750 μL Papain içeren tüpe 75 μL DNaz I ekleyin ve dikkatlice karıştırın (ayrışma karışımı).
- Bu protokol için gerekli olan bireysel numune hazırlama için, 825 μL'lik toplam hacmi üç alikota bölün: fare başına 1,5 mL'lik bir tüpte (iki retina) 275 μL karışım. Gerekli DNase I ve Papain miktarlarını buna göre hesaplayın.
not: Bir tüp Papain / DNase I karışımında altı adede kadar retina ayrışabilir. Bununla birlikte, bireysel numune hazırlama, birleşik numunelere göre daha az topaklanma ve daha iyi hücre büyümesi ile sonuçlanır.
- İki retinayı Papain/DNaz I ayrışma karışımına aktarın. Genişletilmiş uç çapına sahip bir transfer pipeti kullanın, retinaları alın, retinalar ucun dibine yerleşene kadar bekleyin ve ardından retinaları aşırı Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) olmadan Papain / DNaz I karışımı içeren tüpe bırakın.
- Bir nutatör üzerine yerleştirin ve bir hücre kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2) 10 dakika inkübe edin.
- 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı (yaklaşık 20-30 kez) pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra (yani, topaksız homojen bir çözelti elde edildi), Papaini nötralize etmek için Papain Ayrışma Kitinden 275 μL Ovomucoid proteaz inhibitörü ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. NOT: 825 μL Papain/DNaz I karışımında altı retina ayrışmışsa, 825 μL Ovomucoid gereklidir.
- Karışımı 300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- 37 ° C'de önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine (fare başına 1 mL) epidermal büyüme faktörü (EGF, büyüme ortamının 1 mL'si başına 1 μL, PBS'de 200 μg / mL'de yeniden oluşturulur) ekleyin.
NOT: Deney tasarımına bağlı olarak, proliferasyon markörü 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ve ayrıca 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT) veya diğer gerekli faktörler kültür periyodunun başında eklenebilir.
- Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Tüpün altındaki pelete dokunmayın.
- Süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Hücre peletini 500 μL EGF takviyeli büyüme ortamı ile yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu etiketli 12 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 1C). Tüpü 500 μL başka bir EGF takviyeli büyüme ortamı ile durulayın ve kuyuya ekleyin (kuyu başına toplam hacim 1 mL).
- 1.8 ve 1.9 adımlarını diğer tüm örneklerle tekrarlayın.
- Kuyu plakasını üç kez dikkatlice sallayın (ileri geri; sola ve sağa). Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 °C, CO2).
not: Transgenik fareler kullanılıyorsa, her hayvan için genotipleme yapın (Şekil 1D). Cre rekombinaz pozitif ve negatif fareleri tanımlayın ve plakayı buna göre etiketleyin. Bu protokol için, sonraki adımlar için sadece Cre rekombinaz pozitif raportör farelerin hücreleri kullanıldı. Cre negatif örneklerin hücreleri dondurulur ve diğer uygulamalar için kullanılır.
2. Büyüme aşaması
NOT: Büyüme aşamasının süresi yaklaşık 4-5 gündür (Şekil 2B). Hücre içeren kuyucuklara sıvı eklemek için, pipetin kuyu duvarına bakması ve hücre ayrılmasını önlemek için sıvının yavaşça serbest bırakılması gerekir. Doğrudan hücrelerin üzerine pipetlemeyin.
- Ayrışmadan bir gün sonra, ortamı çıkarın ve 1 mL taze EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
- 3. günde, ortamı çıkarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Yavaşça ileri geri sallayın, soldan sağa. HBSS'yi çıkarın, yıkama adımını tekrarlayın ve 1 mL önceden ısıtılmış EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
- Hücreleri her gün izleyin ve hücreler% 90 -% 100 birleşmeye ulaşana kadar büyüme durumlarını değerlendirin. Şekil 3, zaman içinde iyi MG büyümesinin bir örneğini göstermektedir. Olası kontaminasyon veya hücre ölümü olup olmadığını kontrol edin. Kirlenmiş kültürleri atın.
not: Hücre durumunu izlemek ve kaydetmek için, bağlı bir kamera ve 4x, 10x veya 20x objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak çeşitli büyütmelerde görüntüler alın. Bu çalışmada bir floresan mikroskobu kullanılmıştır.
3. Poli-L-ornitin (Poly-O) ve Laminin kaplama ile lamellerin hazırlanması
NOT: Bu adım yalnızca immünofloresan etiketleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu gerçekleştirildiğinde gereklidir. Doğru görüntüleme için yuvarlak cam lameller (12 mm çapında) gereklidir. Kaplama protokolü ayrıca nöronal ortam veri sayfasında da bulunabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Steril lamelleri, steril Dumont #2AP forseps kullanarak 24 oyuklu bir plakanın her kuyusunun ortasına dikkatlice yerleştirin.
not: Lamelleri kuyunun ortasına yerleştirin. Lamelleri bir kuyunun duvarına yakın yerleştirmek, sonraki adımlar için yüzey gerilimi sorunlarına neden olacaktır.
- 2.5 mL'lik bir Poly-O alikotunu oda sıcaklığında çözdürün ve 100 μL'sini her lamelin ortasına yerleştirin.
- Kuyu plakasını 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Poly-O'yu çıkarın ve lamel ile kuyuyu ~ 1 mL steril su ile üç kez yıkayın.
- Kuyu plakasını BSC'de gece boyunca kurumaya bırakın. 2.5 mL Laminin'i gece boyunca 4 ° C'de çözdürün.
- Ertesi sabah, her lamel ortasına 100 μL Laminin ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 4 saat inkübe edin.
- Laminin'i dikkatlice ve tamamen çıkarın.
- Geçiş hemen yapılamıyorsa plakayı 4 °C'de tutun.
not: Hazırlanan plakalardaki kaplanmış lameller 4 °C'de birkaç gün bekletilebilir.
>4. Nöronal hayatta kalanları çıkarmak için hücre geçişi
NOT: Hücre geçişi, hücre popülasyonunu artırmak için değil, nöronal hücreleri çıkarmak için gereklidir. Glia sadece birkaç kez bölünür ve geçişten sonra daha fazla büyümez. Hücre süspansiyonlarını seyreltmeyin. 12 oyuklu bir plakanın bir birleşik kuyusunun hücreleri, 12 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna veya 24 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna dağıtılabilir. Kaplamalı lameller kullanıldığında, lamellerin sadece yaklaşık üçte biri kaplanır. Bu nedenle, 24 oyuklu bir plakada oturan, birleşik hücrelere (~% 80 -% 90) sahip altı lamel 12 oyuklu bir plakanın birleşik hücrelerinin bir oyuğundan elde edilebilir. Hücre yoğunluğunu artırmak veya azaltmak için başka oranlar da seçilebilir. Bu protokol için bir Cre + raportör fare kullanılır [bir deney, iki tedavi: miR-25 veya kontrol-miR; teknik kopyalar n = 3 (tedavi başına üç lamel), biyolojik kopya n = 1]. Teknik ve biyolojik kopyaların sayısı, deney tasarımına bağlı olarak farklı şekilde tanımlanabilir.
- Hücrelerin% 90 -% 100 birleşik olup olmadığını kontrol edin (ayrıca kuyu kenarında; Şekil 3E,F).
- Ortamı çıkarın ve yıkamak için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Plakayı hafifçe sallayın (ileri geri, sola ve sağa). HBSS'yi tamamen kaldırın.
- Hücreleri kuyudan ayırmak için 500 μL önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözelti (metal bir boncuk banyosunda 37 ° C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. Nazikçe sallayın (ileri geri, soldan sağa) ve 37 °C'lik bir inkübatörde 2 dakika inkübe edin.
- Plakayı inkübatörden BSC'ye taşıyın. Eğme sırasında, tripsin içeren çözeltiyi aspire edin ve hücreler tamamen ayrılana kadar kuyu üzerinde birkaç kez dikkatlice ve yavaşça dağıtın. Plakayı ışığa karşı tutun ve altta hücre kalmadığından emin olun.
- Bu hücre süspansiyonunu steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve önceden ısıtılmış büyüme ortamından (EGF; 1:1000 ile desteklenmiş) 600 μL (6 kuyu / lamel için kuyu başına 100 μL) ekleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin. ve ~30-40 kez yukarı ve aşağı pipetleme.
not: Hücreler bu sırada -80 °C'de veya sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve hücre hatlarının çözülmesi için standart protokoller izlenerek buzu çözülebilir. Hücreler donarsa, EGF takviyeli bir ortamda (büyüme ortamı) yeniden süspanse edilmezler. Bazik bir ortamda (EGF olmadan) ve dondurma çözeltisinde (1/1 oranında) yeniden süspanse edileceklerdir.
- 600 μL'lik hücre/ortam süspansiyonunun 100 μL'sini 24 oyuklu plakanın altı kaplamalı lamel ortasına (bkz. adım 5) yerleştirerek hücreleri tohumlayın. Plakayı dikkatlice inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin yerleşmesine izin verin.
NOT: 600 μL'lik hücre süspansiyonunun 100 μL'si (12 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan hasat edilir), transfeksiyon için gerekli olan% 90 -% 100 hücre birleşmesi ile sonuçlanacaktır.
- Lameli üzerine yerleşip yerleşmediklerini görmek için hücreleri 3 saat sonra kontrol edin. EGF.
NOT: Hücreler genellikle ertesi gün transfeksiyon için hazırdır (Şekil 3G). Birleşmezse (% 90 -% 100), onları başka bir gün için bırakın. Hala birleşmiş değilse, bunları transfeksiyon için kullanmayın. MiRNA profillemesi, RNA-Seq, RT-qPCR veya western blot gibi diğer aşağı akış uygulamaları yapılırsa, hücrelerin 12 oyuklu plakalara (1: 1 oranı; plaka tedavisi gerekmez) geçirilmesi ve RNA / protein ekstraksiyonu için hasat edilmesi gerekir.
