Method Article

Fare Retinalarından Elde Edilen Müller Glial Hücre Kültürünün Kurulması

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Kang, S., et al. MicroRNA Tedavisinden Sonra Murin Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek İçin Birincil Hücre Kültürleri. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, fare retinalarından izole edilen Müller glial (MG) hücrelerinin kültürlenmesini göstermektedir. Retinalar, sindirim enzimleri kullanılarak tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır. Hücreler daha sonra MG hücre proliferasyonunu ve nöronal hücre ölümünü destekleyen bir büyüme faktörüne sahip bir ortamda büyütülür. Ölü nöronal hücreler geçerken çıkarılır ve MG hücreleri daha fazla analiz için büyütülür.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>Yasal Uyarı: Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Retina ayrışması

NOT: Aşağıdaki tüm adımların (hücre hasadına kadar) bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Papain/DNase I ayrışma karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Altı retina için, 750 μL Papain içeren tüpe 75 μL DNaz I ekleyin ve dikkatlice karıştırın (ayrışma karışımı).
    2. Bu protokol için gerekli olan bireysel numune hazırlama için, 825 μL'lik toplam hacmi üç alikota böl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Retina ayrışması ve genotipleme. (A) Kornea, lens, iris ve vitreus çıkarılmış göz kabı. (B) İzole retinalar; retina pigment epitel (RPE) hücreleri kapsamlı bir yıkamadan sonra çıkarılır. (C) Ayrışmış retinalara sahip 12 oyuklu plaka (oyuk başına iki retina). (D) Bir genotipleme jel görüntü örneğinin kesilmesi. Genotipleme, Ascl1 güdümlü Cre rekombinaz ekspresyonuna sahip fareleri tanımlama.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hayvan
Ascl1-CreERT fare Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratuvarları#012882Ascl1-CreERT fareleri, tdTomato fareleri ile çaprazlandı
tdTomato-STOPfl/fl fare B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / JJax laboratuvarları#007914Ascl1CreER pozitif fareleri tanımlamak için genotipleme gereklidir
Reaktif
Poli-L-ornitin hidrobromürSigma-AldrichP4538-50MGsteril suda sulandırılmış, donmuş alikotlar
N-2 TakviyesiBalıkçı Bilimsel17-502-048donmuş alikotlar
Nörobazal OrtaBalıkçı Bilimsel21-103-049bölüm 1.1'de büyüme ortamı için kullanılır, 4 ° C'de saklayın
Papain Ayrışma SistemiWorthington BiyokimyasalLK003153Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisinde sulandırılmış, donmuş alikotlar
Penisilin StreptomisinBalıkçı Bilimsel15-140-122donmuş alikotlar
L-GlutaminBalıkçı Bilimsel25-030-081donmuş alikotlar
HBSS (Türkçe)Balıkçı Bilimsel14-025-1344 °C'de saklayın
Fetal Sığır Serumu (FBS)Balıkçı BilimselMT35010CVdonmuş alikotlar
Plastik Eşyalar/Sarf Malzemeleri
0.6 mL mikrosantrifüj tüpüBalıkçı Bilimsel50-408-120
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüBalıkçı Bilimsel50-408-129
10 μL UÇ steril filtre Pipet UçlarıBalıkçı Bilimsel02-707-439
100 μL UÇ steril filtre Pipet UçlarıBalıkçı Bilimsel02-707-431
1000 μL TIP steril filtre Pipet UçlarıBalıkçı Bilimsel02-707-404
2.0 mL mikrosantrifüj tüpüBalıkçı Bilimsel50-408-138
20 μL UÇ steril filtre Pipet UçlarıBalıkçı Bilimsel02-707-432
Ayarlanabilir Hacimli Pipetler (2,5, 10, 20, 100, 200 ve 1000 μL)Eppendorf Belediyesi2231300008
Tek Kullanımlık Transfer PipetleriBalıkçı Bilimsel13-669-12
Çok Kuyulu Kapaklı Düz Tabanlı Plakalar, Kuyu Sayısı=12Balıkçı Bilimsel08-772-29
Çok Kuyulu Kapaklı Düz Tabanlı Plakalar, Kuyu Sayısı=24Balıkçı Bilimsel08-772-1
PIPET steril filtre 10ML Tek Kullanımlık Serolojik PipetlerBalıkçı Bilimsel13-676-10J
PIPET steril filtre 50ML Tek Kullanımlık Serolojik PipetlerBalıkçı Bilimsel13-676-10Q
PIPET steril filtre 5ML Tek Kullanımlık Serolojik PipetlerBalıkçı Bilimsel13-676-10H
Pudrasız Nitril Muayene EldivenleriBalıkçı Bilimsel19-130-1597B
Yuvarlak lameller (12 mm çap, 0,17 - 0,25 mm kalınlık)Balıkçı Bilimsel22293232
Vakum Filtresi, Gözenek Boyutu=0.22 μmBalıkçı Bilimsel09-761-106
ekipman
1300 B2 Biyogüvenlik kabiniTermo Bilimsel1310
Hepsi Bir Arada Floresan Mikroskobu Keyence BZ-X 810Keyence (Cesaret)9011800000
Binoküler Zoom Stereo MikroskopVizyon BilimselVS-1EZ-IFR07
Tek Kullanımlık Petri Kapları (100 mm çap)VWR (VWR)25384-088
Dumont #5 Forseps - Biyoloji/TitanyumGüzel Bilim Araçları11252-40
Dumont #55 Forseps - Biyoloji/InoxGüzel Bilim Araçları11255-20
Dumont #7 kavisli Forseps - Biyoloji/TitanyumGüzel Bilim Araçları11272-40
Eppendorf Santrifüj 5430 REppendorf Belediyesi2231000508
Su Ceketli CO2 İnkübatörüVWR (VWR)10810-744
Gazetesi Serisi arası

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Muller Glial CellsMouse Retina CultureRetinal Cell DissociationPapain DNase I TreatmentEpidermal Growth Factor SupplementCell Passaging ProtocolNeuronal Cell RemovalCentrifugation at 300gTrypsin Based DetachmentGrowth Medium Supplementation

Related Articles