$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Tampon hazırlama
>NOT: Aşağı akış RNA dizilimi gerçekleştiriyorsanız, mRNA bozulmasını önlemek için tüm çalışma alanlarını ve araçları RNase Dekontaminasyon Solüsyonu ile kapsamlı bir şekilde tedavi edin.
- Lizis tamponu hazırlayın.
- Aşağıdakileri 50 mL'ye kadar damıtılmış suda (H2O) çözün: 5.47 g sükroz (0.32 M final), 250 μL 1 M kalsiyum klorür (CaCl2) (5 mM final), 150 μL 1 M magnezyum asetat (Mg (CH3COO) 2) (3 mM final), 10 μL 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (0.1 mM final), 500 μL 1 M Tris-hidroklorik asit (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM final), 50 μL Triton X-100 (%0.1 final) ve 17 μL 3 M ditiyotreitol (DTT, 1 mM final, taze ekleyin) (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Sükroz tamponu hazırlayın
- Aşağıdakileri damıtılmış H2O'da 50 mL'ye kadar çözün: 30.78 g sükroz (1.8 M final), 150 μL 1 M Mg (CH3COO) 2 (3 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL 3 M DTT (1 mM final, taze ekleyin).
2. Donmuş dokunun tek çekirdekli süspansiyona ayrışması
- 7 mL'lik bir cam doku douncer'a (öğütücü) 4 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde tutun. Taze dondurulmuş insan yetişkin korteksinin yaklaşık 200-400 mg'ını diseke edin, yaklaşık 50 kat edin ve doku homojenatını 12 mL ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.
- 5 mL'lik bir pipet kullanarak, ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mL buz gibi soğuk sükroz tamponu ekleyin ve sükroz ile doku homojenatı arasındaki tabakayı bozmamaya dikkat edin.
NOT: Ek numuneler işleniyorsa, daha hafif numuneye ek lizis tamponu ekleyerek tüpleri ağırlıkça dikkatlice dengeleyin. Rotorun hasar görmesini önlemek ve uygun hızda dönüşü sağlamak için ultrasantrifüj tüplerinin hassas bir şekilde dengelenmesi çok önemlidir.
3. Ultrasantrifüjleme
- Lizatı 24.400 rpm'de (101.814 × g) 4 °C'de 1 saat boyunca ultrasantrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı ve kalıntıları dikkatlice aspire edin.
not: 200 mg'dan daha az doku ile başlanırsa bir pelet görünmeyebilir.
- Çekirdek peletine 600 μL fosfat tamponlu salin (PBS) (Kalsiyum (Ca2 +), Magnezyum (Mg2 +) içermez) ekleyin ve yeniden süspanse etmeden önce 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Çekirdek peletini buz üzerinde yeniden süspanse etmek için 50 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Sağlam çekirdekleri mikroskop altında görselleştirmek ve bir sonraki adıma geçmeden önce yeniden süspansiyon konsantrasyonunun 105 çekirdek / mL'nin üzerinde olduğundan emin olmak için bir hemositometre kullanın (yeniden süspanse edilmiş çekirdeğin 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile birleştirin).
4. Antikor inkübasyonu
- Floresanla aktive edilen çekirdek sınıflandırması (FANS) için numuneyi immünoetiketlemek için, 500 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 490 μL 1x PBS (Ca2 +, Mg2 + ücretsiz), 10 μL %10 sığır serum albümini (BSA) ekleyin (% 0.1 son), AF (Alexa flor) 555'e konjuge 1 μL fare anti-NeuN antikoru (NeuN-AF555, 1: 1000 nihai konsantrasyon), ve allofikosiyanin (PAX6-APC, 1:1000 nihai konsantrasyon) ile konjuge edilmiş 1 μL fare anti-PAX6 antikoru.
not: Diğer floroforlara konjuge alternatif antikorlar eklenebilir. Burada, AF488'e (1:1000 konsantrasyon) konjuge fare anti-OLIG2 kullanıldı ve olumlu sonuçlar elde edildi.
- Gerektiğinde küçük bir miktar numune kullanarak geçit parametrelerini ayarlamak için yalnızca 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve tek renkli kontroller gerçekleştirin.
- AF555 tek renk kontrolü gerçekleştirmek için 20 μL yeniden süspanse edilmiş numune peleti, 970 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ serbest), 10 μL %10 BSA (%0,1 final) ve 1 μL NeuN-AF555 antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.
- APC tek renkli kontrol gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden süspanse edilmiş numune peleti, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ serbest), 10 μL %10 BSA (%0.1 final) ve 1 μL PAX6-APC antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.
- Yalnızca DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) kontrolünü gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 970 μL 1X PBS (Ca2 +, Mg2 + ücretsiz) ve 10 μL %10 BSA (% 0.1 final) ekleyin (DAPI daha sonra eklenecektir, bkz. 4.4).
not: İkiden fazla antikor kullanılıyorsa, tek renkli kontrollere ek olarak floresan eksi bir (FMO) kontrolü yapılması önerilir.
- Numuneleri ve kontrolleri karanlıkta 4 °C'de 1 saat döndürerek inkübe edin.
- Tüm örneklere ve kontrollere 1:1000'de DAPI ekleyin ve sıralamaya devam edin.