Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Doku Toplama
- Tampon X'e 0.067 mM'lik bir nihai konsantrasyona beta-merkaptoetanol ekleyerek Nöral Ayrışma Kitinden Tampon X'i hazırlayın (4 numune için, 10 ml Tampon X'e 13.5 μl 50 mM beta-merkaptoetanol ekleyin).
- Nöral Dissosiyasyon Kiti protokolünde açıklandığı gibi her numune için 50 μl Enzim P'yi 1.900 μl Tampon X ile karıştırarak Enzim Karışımı 1'i hazırlayın Örneğin, 4 numune için 200 μl Enzim P'yi 7.600 μl Tampon X ile karıştırın.
- Buffer X'i 37 ºC'deki su banyosuna yerleştirin.
- Doku diseksiyonu için toplanacak ve buz üzerinde tutulacak her numune için 2 ml soğuk Hank'in Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) (Ca++ ve Mg++ olmadan) steril 6 oyuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna yerleştirin.
2. Nöral Ayrışma (1 saat)
- Her doku örneğini, 6 oyuklu kültür plakasının kapağındaki steril tıraş bıçakları kullanarak küçük parçalara ayırın. Bu protokol yaklaşık 30 - 100 mg'lık doku örnekleri için kullanılmıştır, ancak 400 mg'a kadar olan doku örnekleri için onaylanmıştır. 400 mg'dan büyük doku numuneleri için reaktif hacimleri uygun şekilde ölçeklendirilmelidir.
- Doğranmış doku parçalarını bir pipet ile steril 2 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için Ca2+ ve Mg2+ içermeyen 1 ml taze HBSS kullanın. Tüm numuneler 2.1 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarılana kadar tüm numuneler için 2.2 ve 2 adımlarını tekrarlayın.
- Numuneleri RT'de 2 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
- Her numuneye Adım 1.2 ve 1.3'te hazırlandığı gibi 1.900 μl ılık Enzim Karışımı 1 ekleyin ve tüpleri kapatın.
- Numuneleri 37 ºC'lik su banyosunda 15 dakika inkübe edin, çöken doku parçalarını yeniden süspanse etmek için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
- Bu arada, 20 μl Tampon Y'yi 10 μl çözülmüş Enzim A ile karıştırarak Enzim Karışımı 2'yi hazırlayın (4 numune için 80 μl Tampon Y'yi 40 μl çözülmüş Enzim A ile karıştırın).
- Her numuneye 30 μl Enzim Karışımı 2 ekleyin ve yavaşça ters çevirin. Girdap yapmayın.
- Her doku örneğini Pasteur pipeti "1" ile 30 kez yukarı ve aşağı tritüre ederek ayırın.
- Numuneleri 37 ºC su banyosunda 15 dakika inkübe edin; çökelmiş doku parçalarını yeniden askıya almak için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
- Her doku örneğini Pasteur pipeti "2" ile ayırın, 30 kez yukarı ve aşağı tritüre edin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Her bir doku örneğini Pasteur pipeti "3" ile ayırın, 30 kez yukarı ve aşağı tritüre edin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Numuneleri 37 ºC su banyosunda 10 dakika inkübe edin; çökelmiş hücreleri yeniden askıya almak için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
- Büyük kalıntıları temizlemek için 15 ml'lik bir falcon tüpünün üzerine yerleştirilen 80 mikronluk bir hücre suşuna tek hücreli süspansiyon uygulayın ve enzim reaksiyonlarını durdurmak için filtreyi ve hücreleri 10 ml HBSS (Ca2+ ve Mg2 + ile) ile yıkayın. Her numune 15 ml'lik temiz bir şahin tüpüne aktarılana kadar tekrarlayın.
- Numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
3. Miyelin Tükenmesi (45 dk)
- Hücre peletini 400 μl miyelin uzaklaştırma tamponu ile iyice yeniden askıya alın.
- Belirli bir miktarda miyelin çıkarma boncukları ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Kullanılan miyelin çıkarma boncuklarının hacmi, dokunun boyutuna, hayvanın yaşına ve söz konusu beyin bölgesinde beklenen miyelin miktarına bağlı olacaktır. Örneğin, yetişkin bir sıçan hipokampus numunesi için (yaklaşık 300 mg), numuneyi 100 μl miyelin çıkarma boncuğu ile inkübe edin.
- Buzdolabında 4 ºC'de 15 dakika inkübe edin.
- Her numuneyi 5 ml miyelin giderme tamponu ile yıkayın.
- Numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Numuneleri santrifüj ederken, manyetik ayıklayıcının manyetik alanına her numune için 1 sütun yerleştirin ve her sütunun üzerine 80 mikronluk temiz bir filtre yerleştirin.
- Sütunları hazırlayın ve her sütunu 1 ml miyelin giderme tamponu ile üç kez (toplam 3 ml) durulayarak süzün. Tüm akışı, boş bir uç kutusunun dibi gibi bir atık kabında toplayın.
- Numune toplamaya hazırlanırken 5 ml'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpü doğrudan her sütunun altına yerleştirin.
- Hücreler santrifüjlemeyi bitirdiğinde, süpernatanı aspire edin ve 500 μl miyelin uzaklaştırma tamponunda iyice yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hemen kolona uygulayın ve hücreleri aşağıdaki tüpte toplayın.
- Filtreyi ve kolonu 1 ml miyelin giderme tamponu ile 4 kez (toplam 4 ml) yıkayın.
- Hücre koleksiyonunu RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve hücreler artık lekelenmeye hazırdır.
>4. FACS için Canlı Hücrelerin Boyanması (boyama için 1 saat)
- Peleti ayırmak için hücreleri kısaca girdaplayın (2 saniye) ve hemen 5 μl Fc bloğu (farklılaşma önleyici kümeler 32, CD32) ekleyin, tekrar girdap yapın ve buzdolabında 4 ºC'de 5 dakika inkübe edin.
- Bu arada, yıkama tamponuna üç birincil antikoru aşağıdaki gibi ekleyerek birincil antikor karışımını hazırlayın: 0.125 μl allofikosiyanin (APC) -konjuge CD11b antikoru (1:800), 1 μl anti-GLT1 antikoru (1:100) ve 0.4 μl Floresein izotiyosiyanat (FITC) - konjuge Thy1 antikoru (1:250) her 100 μl yıkama tamponu için. Her numune, inkübasyon için 100 μl primer antikor karışımı alacaktır; Bununla birlikte, numuneniz 400 mg dokudan çok daha büyükse, birincil antikor karışımınızın hacmini buna göre artırmayı düşünebilirsiniz
- Her numune tüpünden sadece 2 μl hücre çıkararak ve her bir leke kontrol tüpüne ekleyerek tek boyama kontrolleri için tüpleri hazırlayın. "Tek leke" kontrolleri şunları içerir: yalnızca APC-CD11b, yalnızca GLT1, yalnızca FITC-Thy1, yalnızca PE ikincil antikoru ve "boş" veya boyanmamış kontrol.
not: Tüm numuneler tüm boyama kontrollerinde temsil edilmelidir, bu nedenle her bir numuneden 2 μl hücre her boyama kontrol tüpüne eklenmelidir.
- Tüpleri kısaca vorteksleyin (2 saniye) ve her numune tüpüne 100 μl primer antikor karışımı ve her boyama kontrol tüpüne 100 μl uygun primer antikor ekleyin, tüpleri tekrar vorteksleyin, floresan antikorları herhangi bir ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve tüpleri buzdolabında 4 ºC'de 20 dakika inkübe edin. Numunelerin ve antikorların bütünlüğünü korumak için prosedürün geri kalanında numuneler soğuk tutulmalıdır (4 ºC'de).
- Tüpleri kısaca vorteksleyin ve her tüpe 2 ml yıkama tamponu ekleyin.
- Tüpleri 350 x g'da 4 ºC'de 5 dakika
santrifüjleyin.
- Bu arada, her 100 μl yıkama tamponu için 0.2 μl PE konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ekleyerek ikincil antikor karışımını hazırlayın. Her numune 100 μl ikincil antikor karışımı alacaktır; Bununla birlikte, numuneniz 400 mg dokudan çok daha büyükse, birincil antikor karışımınızın hacmini buna göre artırmayı düşünebilirsiniz.
- Santrifüjleme tamamlandığında, her bir numunedeki süpernatanı lavaboya boşaltın ve tüpleri bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın.
- Tüpleri kısaca vorteksleyin ve her numune tüpüne 100 μl ikincil antikor karışımı ve her boyama kontrolüne uygun ikincil antikor ekleyin. Daha sonra tüpleri tekrar girdaplayın, alüminyum folyo ile kaplayın ve buzdolabında 4ºC'de 15 dk.
not: Sadece GLT1 boyama kontrol tüpü ikincil antikor karışımını almalıdır.
- İnkübasyondan sonra, tüpleri kısaca vorteksleyin ve her tüpe 2 ml yıkama tamponu ekleyin.
- Tüpleri 350 x g'da 4ºC'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjleme tamamlandığında, her bir numunedeki süpernatanı lavaboya boşaltın ve tüpleri bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın.
- Tüpleri vorteksleyin ve her tüpe 0.25 ml steril PBS ekleyin. Numuneler tasnif için hazır.
not: Daha fazla hücre 0.5 ml steril PBS gerektirebilir; Bununla birlikte, numune hücrelerle çok konsantre edilirse her zaman seyreltilebileceğinden, daha düşük bir hacimle başlamak en iyisidir.
not: Hücrelerin topaklanmasını ve böylece sıralayıcıyı tıkamasını önlemek için isteğe bağlı olarak tüpe DNaz ekleyin. Numuneler, ayıklayıcının tıkanmasını önlemek için tasniften hemen önce 80 mikronluk steril bir filtre kullanılarak da filtrelenebilir.
