Floresanla Aktive Edilen Hücre Sınıflandırması ile Caenorhabditis elegans'tan Nöronların İzolasyonu

Özet

Kaynak: Almanya, E. M., et al. Roundworm Caenorhabditis elegans'tan Belirli Nöron Popülasyonlarının İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, Caenorhabditis elegans'tan floresan olarak işaretlenmiş nöronların izolasyonunu göstermektedir. Kolinerjik nöronlarda floresan proteinle kaynaşmış veziküler transmembran taşıyıcıları eksprese etmek için tasarlanmış transgenik solucanlardan bir hücre süspansiyonu elde edilir. Floresan olarak işaretlenmiş nöronlar daha sonra floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak izole edilir ve kültürde tutulur.

Protokol

1. Hücre izolasyonu için yaşlanmış solucanların hazırlanması ve toplanması

1. Solucanları toplayın ve hücre izolasyonu için tamponlar hazırlayın.
   1. Solucanları 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Solucanları plakadan 1.5 mL M9 tamponu (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 22 mM KH₂PO₄, pH 7.0) ile yıkayın ve 1.600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve solucanları 1 mL M9 tamponu ile yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve mümkün olduğunca fazla Escherichia coli kontaminasyonunu gidermek için toplam beş kez yıkayın.
      NOT: Bu adımda ampisilin gibi antibiyotiklerin (50 μg/mL) eklenmesi bakteriyel kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olabilir.
   2. İki numune için 2 mL sodyum dodesil sülfat-ditiotreitol (SDS-DTT) lizis tamponu hazırlayın: 200 mM DTT, %0.25 (a/h) SDS, 20 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit) (pH 8.0) ve %3 (a/h) sükroz.
   3. 15 mL izolasyon tamponu (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
      not: Hem SDS-DTT lizis tamponu hem de izolasyon tamponu her deneyden önce taze hale getirilmelidir.
2. Kütikül bozulması ve tek hücre izolasyonu
   1. Adım 1.1.1'de toplanan hayvanları 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin. Tüm süpernatanı çıkarın ve solucanları 1 mL M9 ortamında askıya alın ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleme ile pelet solucanları.
   3. Solucanlara 200 μL SDS-DTT lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. Solucanlar, ışık mikroskobu altında bakıldığında vücut boyunca "göz kırpılmış" gibi görünmelidir.
      not: SDS-DTT lizis tamponuna uzun süre maruz kalmak, solucanların ölümüne neden olabilir ve bu da solucanlar gözlemlenerek izlenebilir. Ölü olan solucanlar uzar ve kıvrılmaz.
   4. 800 μL buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe vurarak karıştırın.
   5. Pelet kurtlarını 4 ° C'de 13.000 x g'da 1 dakika boyunca çıkarın, süpernatanı çıkarın ve 1 mL izolasyon tamponu ile yıkayın.
   6. Adım 1.3.5'i toplam beş kez tekrarlayın ve her seferinde izolasyon arabelleğini dikkatli bir şekilde çıkarın.
   7. İzolasyon tamponunda çözülmüş Streptomyces griseus'tan (15 mg/mL) (Malzeme Tablosu) 100 μL proteaz karışımını pelete ekleyin ve RT.
      'de 10-15 dakika inkübe edin not: SDS-DTT lizis tamponunda olduğu gibi, genişletilmiş proteaz sindirimi, plazma zarı boyunca proteinlerin aşırı bölünmesine neden olabilir ve yüzeye maruz kalan yeşil floresan proteinin (GFP) manyetik boncuklar yoluyla izolasyonunu önleyebilir.
   8. Proteaz karışımı ile inkübasyon sırasında, numuneleri 1.5 μL'lik mikropipet ucu ile 200 μL'lik mikrosantrifüj tüpünün dibine ~60-70 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik bozulma uygulayın. Hücreleri düzgün bir şekilde ayırmak için pipet ucunu mikrosantrifüj tüpünün duvarına sabit basınçla tutun.
   9. Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımından küçük bir hacim (~1−5 μL) çıkarın, bir cam lam üzerine bırakın ve bir doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin. 5-7 dakikalık inkübasyondan sonra, solucan parçaları gözle görülür şekilde azaltılmış kütiküle sahip olmalı ve bir hücre bulamacı kolayca görülebilecektir.
   10. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (50 U / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin'de nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş, ticari olarak temin edilebilen 900 μL soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ile reaksiyonu durdurun.
   11. Pelet izole edilmiş fragmanları ve hücreleri, 4 ° C'de 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile izole edin. Fazla kalıntı ve kütikülün çıkarıldığından emin olmak için peletlenmiş hücreleri 1 mL soğuk L-15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın.
   12. Peletlenmiş hücreleri 1 mL L-15 takviyeli ortamda yeniden süspanse edin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın. Yaklaşık 700−800 μL olan üst tabakayı bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Bu katman, hücre kalıntısı olmayan hücreleri içerir ve ilgilenilen hücrelerin sonraki izolasyonunda kullanılacaktır.
   13. Üreticinin talimatlarına göre, 10-25 μL izole hücrelerin hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın.

2. Akış sitometrisi ile GFP pozitif hücrelerin izolasyonu

1. GFP pozitif hücrelerin akış sitometrisi ile izolasyonu
   1. Adım 1.2.12'de toplanan izole hücre süspansiyonundan, hücreleri 4 ° C'de 10.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Akış sitometresinin aşırı yüklenmesini önlemek için süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri L-15 takviyeli ortamda 6 x 10⁶ hücre / mL'den fazla olmayan bir hücre yoğunluğuna askıya alın.
   2. Numuneleri sıralayabilen bir akış sitometresi kullanarak hücreleri GFP-pozitif ekspresyona göre sıralayın. GFP-negatif hücreler, hücre tipine özgü olmayan analizler için bir kontrol olarak kullanılabilir.
2. İzole edilmiş hücrelerin kültürlenmesi
   1. Plaka, hücreleri steril 6 oyuklu çok kuyulu bir plakaya izole edin.
      not: Bu plakalar, hücre bağlanmasını artırmak için yer fıstığı lektini ile kaplanabilir; Bununla birlikte, hücreler hemen kullanılacaksa, bu adım göz ardı edilebilir.
   2. Plakayı plastik bir kaba yerleştirin ve hücreleri nemli bir mendil veya yumuşak kağıt mendil ile 20 °C'de inkübe edin (silme işleminde bakteri üremesini önlemek için çift damıtılmış suya [ddH₂O] 50 μg/mL ampisilin ekleyin) hücrelere nem eklemek için. Yüksek CO₂ seviyeleri hücrelere zarar verebileceğinden, bir CO₂ inkübatöründe inkübe etmeyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oyuklu plaka	Balıkçı Bilimsel	12-556-004
Ağar, Moleküler Biyoloji Sınıfı	VWR (VWR)	A0930
CaCl2	Sigma	C5670 Serisi
Contess Otomatik Hücre Sayacı	Canlandırıcı	Z359629
DTT (DTT)	USBiyolojik	D8070 Serisi
FBS (FBS)	Omega Bilimsel	FB-02
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma	H3375
Kartal	Amresco Belediyesi	O395
KH2PO4	USBiyolojik	P5110 Serisi
Kimmendil	Kimberly-Clark Profesyonelleri	7552
Leibovitz'in L-15 Orta	Gibco (Gibco)	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiyolojik	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiyolojik	S5199 Serisi
NaCl (Doğal)	VWR (VWR)	X190
NaOCl (Çamaşır Suyu)	Clorox Gölü
NaOH (NanoOH	Amresco Belediyesi	O583
Penisilin-Streptomisin	Balıkçı Bilimsel	15140122
Pepton Y	USBiyolojik	P3306 Serisi
Pronaz E	Sigma	7433	Streptomyces griseus'tan proteaz karışımı
SDS (Demokratik Güç)	Amresco Belediyesi	O227
SMT1-FLQC floresan stereomikroskop	Tritech Araştırma
Sakaroz	USBiyolojik	S8010 Serisi

Serisi Serisi Serisi Serisi sayılı Kanun Hükmünde Kararname Serisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi