Embriyonik Civciv Beyninden Beyincik Dilimleri Elde Edilmesi

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tavuk Embriyosunun Diseksiyonu 14. Gün (e14) Beyincik

1. Kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını 38 °C'de embriyonik 14. güne kadar kuluçkaya yatırın.
2. Yumurta makası kullanarak, civciv embriyosunu ovo içinde dekapite edin ve kafayı buz gibi soğuk Fosfat tampon salin (PBS) içeren bir Petri kabına çıkarın (Şekil 1A).
3. Standart forseps kullanarak, her bir gözün arkasında, doku boyunca tamamen kesiler yapın, gözleri ve üst çeneyi çıkarın. Alt çeneyi çıkararak farenks boyunca ikinci bir kesi yapın (Şekil 1B).
4. Standart forseps kullanarak, bir kafatasının yüzeyindeki tüm cildi soyarak çıkarın (Şekil 1C) ve beyni ortaya çıkaran frontal ve parietal kemikleri çıkarın.
5. Ventral açıdan, faringeal kıkırdak ve yardımcı mezenşi çıkarın.
6. Dorsal açıdan, pia'ya zarar vermemeye dikkat ederek mezenşim dorsalini arka beyne dikkatlice çıkarın ve tüm beyni ayırın (Şekil 1D).
7. Orta beyin ile arka beyin arasındaki doku boyunca bir kesi yapın ve beyincik de dahil olmak üzere arka beyni ayırın (Şekil 1E).
8. Diseksiyon boyunca pia'nın bütünlüğünü korumaya özen göstererek, serebellumun her iki lateral bileşkesinde ve arka beynin alar plakasında doku boyunca kesiler yaparak tüm serebellumu çıkarın (Şekil 1F). Ayrıca, oluşan koroid pleksusu çıkarın (Şekil 1G).
9. Disseke edilmiş beyinciği buz gibi Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) taşıyın.

2. e14 Beyincik Dilim Kültürü

1. Tüm beyinciği, bir spatula veya 3 ml'lik bir Pasteur pipeti kullanarak, açıklığı genişletmek için ucu kesilmiş olarak bir Doku Kıyıcı'nın steril platformuna aktarın. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın.
2. Maksimumun %50'sinde bir kesme hızına sahip doku doğrayıcı setini kullanarak tüm beyinciği 300 μm kalınlıkta istenen yönde kesin. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; bununla birlikte, oryantasyon da hücre analizi için önemli bir husustur (Purkinje hücre dendritleri sagittal olarak hizalanırken, granül hücre aksonları Purkinje hücre dendritlerinin düzlemine dik olarak enlemesine uzanır).
3. 3 ml'lik bir Pasteur pipeti kullanarak dilimlenmiş beyinciği buz gibi HBSS ile kaplayın.
4. HBSS'deki dilimleri, kesilmiş uçlu 3 ml'lik bir Pasteur pipeti kullanarak buz gibi taze HBSS içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
5. Fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında, saatçi forseps kullanarak tek tek dilimlerin ayrıldığından emin olun.
   not: Embriyodan kültür ortamında dilim inkübasyonuna kadar her diseksiyon, deneyime bağlı olarak yaklaşık 10-20 dakika sürer. Serebellanın dekapitasyon ile ex vivo kültür arasında minimum süreyi geçirmesini sağlamak için birer birer diseksiyon yapın.

Şekil 1. E14 civciv embriyolarından beyincik diseksiyonu. (A) Yumurtadaki civcivin kafasını kesin ve kafasını buz gibi soğuk PBS ile bir petri kabına çıkarın. Gözlerin ve farenksin (kesikli çizgi) arkasında bir kesi yaparak alt çeneyi ve gözleri çıkarın. (B) Cildi kafatasının yüzeyinden çıkarın. (C) Frontal ve parietal kemikleri çıkarın ve (D) beyni çevreleyen mezenkim ve kıkırdaktan çıkarın. (E) Diseksiyon mikroskobu altında beynin arka ucundaki beyinciğin yerini belirleyin. Beyincik ve ventral arka beyin ile bırakılacak şekilde orta beyin ile arka beyin (kesikli çizgiler) arasında kesin. (F) Beyinciğı arka beyinden ayırmak için beyinciğin yanal kavşaklarında (pedinküller) kesiler yapın (kesikli çizgi). (G) Pia takılı olarak bütün sağlam bir beyincik kalana kadar serebellumun ventral tarafından koroid pleksusu (yıldız) çıkarın. Bir doku kıyıcı ile dilimler hazırlamadan önce beyinciği buz gibi HBSS'ye aktarın.